A host susceptibility gene, DR1, facilitates influenza A virus replication by suppressing host innate immunity and enhancing viral RNA replication

doi:10.1128/JVI.03610-14

.2015年4月；89(7):3671-82.

doi:10.1128/JVI.03610-14。 Epub 2015年1月14日。

宿主易感基因DR1通过抑制宿主先天免疫和增强病毒RNA复制促进甲型流感病毒复制

徐士峰¹, 文池素², 金宋珍（King-Song Jeng）^三, 迈克尔·M·C·莱⁴

附属公司

¹中国科学院分子生物学研究所，台北，台湾。
²台湾台中中国医科大学台中医院新兴病毒研究中心。
^三中国科学院分子生物学研究所，台北，台湾国家RNAi核心设施，中国科学院，台湾台北。
⁴中国科学院分子生物学研究所，台北，台湾新兴病毒研究中心，中国医科大学医院，台中，台湾中华医科大学，台湾台中michlai@gate.sinica.edu.tw。

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宿主易感基因DR1通过抑制宿主先天免疫和增强病毒RNA复制促进甲型流感病毒复制

徐士峰等。 J维罗尔. 2015年4月.

.2015年4月；89(7):3671-82.

doi:10.1128/JVI.03610-14。 Epub 2015年1月14日。

作者

徐士峰¹, 文池素², 金宋珍（King-Song Jeng）^三, 迈克尔·M·C·莱⁴

附属公司

¹中央研究院分子生物学研究所，台湾台北。
²台湾台中中国医科大学台中医院新兴病毒研究中心。
^三中国科学院分子生物学研究所，台北，台湾国家RNAi核心设施，中国科学院，台湾台北。
⁴中国科学院分子生物学研究所，台北，台湾新兴病毒研究中心，中国医科大学医院，台中，台湾中华医科大学，台湾台中michlai@gate.sinica.edu.tw。

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摘要

甲型流感病毒（IAV）依赖细胞因子完成其复制周期；因此，研究IAV使用的因子可能有助于抗病毒药物的开发。为此，从全基因组RNA干扰（RNAi）筛选中鉴定出一种细胞转录抑制因子DR1。DR1基因敲除（KD）导致病毒RNA和蛋白质生成减少，表明DR1在IAV复制中起到了积极的宿主因子的作用。全基因组转录组分析表明，延长DR1 KD后，干扰素刺激基因（ISG）的表达受到强烈诱导。我们发现，DR1 KD可诱导β-干扰素（IFN-β），从而激活JAK-STAT通路以启动ISG表达，从而强烈抑制IAV复制。这一结果表明，正常细胞中的DR1抑制IFN诱导，可能是为了防止不需要的细胞因子产生，但这种抑制可能会在细胞受到感染后创造一个有利于IAV复制的环境。此外，对病毒RNA复制的生化分析表明，DR1 KD抑制了病毒RNA复制。我们还发现，DR1与病毒RNA-依赖性RNA聚合酶（RdRp）复合物的所有三个亚单位相关，表明DR1可能与病毒RdRp-复合物的单个成分相互作用，以增强病毒RNA复制。因此，DR1可能被认为是一种通过双重机制进行IAV复制的新的宿主易感基因，它不仅可以抑制宿主防御以间接促进IAV复制，还可以直接促进病毒RNA复制。

重要性：研究甲型流感病毒（IAV）复制过程中涉及的病毒-宿主相互作用对于了解病毒的发病机制和宿主防御机制至关重要，这可能会操纵流感病毒感染或防止病毒RNA复制过程中高错误率导致的耐药性的出现。为此，从全基因组RNAi筛选中鉴定出一种细胞转录阻遏物DR1，作为IAV复制的阳性调节物。在当前的研究中，我们发现DR1抑制了大量宿主固有免疫基因的基因表达，这间接促进了IAV感染时IAV的复制。除此之外，DR1还可能通过与病毒RdRp复合物的单个成分相关联，直接增强了病毒RdR1的活性。因此，DR1代表了一种新的通过多种功能进行IAV复制的宿主易感基因，它不仅抑制宿主防御，而且增强病毒RNA复制。DR1可能是开发抗流感病毒感染药物的潜在靶点。

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数字

图1
DR1是IAV复制的积极调节器。用指示的慢病毒转导A549细胞10天以产生稳定的细胞株，然后在MOI为1的情况下感染IAV 6小时，以进行qRT-PCR分析或Western blotting。（A和B）用IAV感染携带shDR1-1、shDR1-2或shLacZ对照的稳定细胞，收获，然后通过使用所指示的抗体进行qRT-PCR测定或蛋白质印迹。手机*DR1（数字参考1）*mRNA和*NP公司*vRNA被测量并归一化为*GAPDH公司*mRNA，对照细胞的值设置为1。数据表示平均值±标准偏差（SD）(n个≥ 3; *,*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。（C）对于过表达测定，用IAV感染8dpt的过表达的Myc标记的DR1（DR1-Myc-OE）或对照（仅载体）细胞，收获，然后进行蛋白质印迹。NP和肌动蛋白的带强度被量化，NP/肌动蛋白比率显示在印迹下方。（D）稳定的DR1 KD和shLacZ对照A549细胞以0.01的MOI感染IAV。在24或48 hpi时，通过菌斑试验滴定上清液，以测定病毒滴度。数据表示平均值±SD(n个≥ 3; *,*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。（E）对于摆动突变体拯救实验，在感染IAV之前，用过度表达DR1摆动突变体（DR1-Myc-wobble）或对照（仅载体）的慢病毒进一步转导DR1 KD（shDR1-1）和shLacZ对照细胞8天，并对细胞裂解物进行Western blotting。

图2
在没有IAV感染的情况下，通过qRT-PCR分析DR1 KD诱导的信号转导子在宿主天然免疫中的表达水平。测量细胞信号传感器mRNA并将其归一化为*GAPDH公司*mRNA，将对照细胞中每个基因的值设置为1。数据表示平均值±SD(n个≥ 3; *,*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。

图3
DR1 KD对*IFNB1公司*在没有IAV感染的情况下，在不同的转染后时间诱导和ISG表达。DR1 KD、ITCH KD和shLacZ对照A549细胞在4、7或10 dpt时感染IAV 6 h，MOI为1，用于qRT-PCR分析或Western blotting。（A和B）蜂窝*DR1（数字参考1）*,痒，或*IFNB1公司*mRNA水平被测定并归一化为*GAPDH公司*mRNA水平。每个条件下shLacZ对照细胞的值设置为1。数据表示平均值±SD(n个≥ 3; *,*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。（C） DR1-KD和shLacZ对照HEK293T细胞在4或10dpt时与pIFN-FLuc和pRL-TK共转染。在转染后24小时，对总细胞裂解物进行萤光素酶活性测定。控制单元格的值设置为1。数据表示平均值±SD(n个≥ 3; *,*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。（D）使用所示抗体对在每种条件下获得的细胞裂解物进行免疫印迹。（E）测定每种条件下的ISG mRNA水平，并将其标准化为*GAPDH公司*mRNA。每个条件下shLacZ对照细胞的值设置为1。数据表示平均值±SD(n个≥3；*，*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。

图4
DR1 KD早期或延长对IAV复制的影响。（A和B）DR1 KD和shLacZ对照A549细胞在4或10 dpt时感染IAV 6 h，MOI为1，用于qRT-PCR分析或使用所示抗体进行Western blotting。*NP公司*测定vRNA水平并将其标准化为*GAPDH公司*mRNA水平。每个条件下shLacZ对照细胞的值设置为1。数据表示平均值±SD(n个≥ 3; *,*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。（C和D）DR1 KD和shLacZ对照A549细胞在4或10 dpt时以10（37°C）的MOI感染IAV达指定时间，收获，然后使用指定抗体进行Western blotting。M1和肌动蛋白的带强度被量化，M1/肌动蛋白比率显示在印迹下方。

图5
取消DR1 KD相关ISG诱导恢复了IAV复制。如顶部所示，用shRNAs转导A549细胞，然后以1的MOI感染IAV 6小时。同时含有shLacZ和shLuc的细胞作为阴性对照。使用所示抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹。NP和肌动蛋白的带强度被量化，NP/肌动蛋白比率显示在印迹下方。

图6
早期DR1 KD影响病毒RNA转录和复制。（A） DR1 KD和shLacZ对照A549细胞在4 dpt时以5（37°C）的MOI感染IAV 15或25 min，收获，然后进行总RNA的亚细胞分离*NP公司*通过qRT-PCR测量不同组分中的vRNA，并将其归一化为*6号机组*snRNA或*GAPDH公司*细胞核部分或细胞质部分的mRNA。vRNA的百分比是每个部分的vRNA量与整个细胞的vRNA的量之比。数据代表两个独立实验的平均值。（B和C）DR1 KD和shLacZ对照A549细胞在4dpt时感染IAV，MOI为1，感染时间为指定时间，收获，然后进行qRT-PCR分析。数据表示平均值±SD(n个≥ 3; *,*P（P）*学生的≤0.05t吨测试）。（D） DR1 KD和shLacZ对照的HEK293T细胞在4 dpt时转染*PB1型*,*PB2型*,*PA公司*、和*NP公司*mRNA，*RLuc公司*-mRNA，以及*FLuc公司*-vRNA（3P/NP），或仅与*FLuc公司*-vRNA和*RLuc公司*-mRNA，作为阴性对照（模拟）。在转染后24小时，对总细胞裂解物进行荧光素酶活性测定。用3P/NP转染的对照细胞的值设置为1。数据表示平均值±SD(n个≥ 3; *,*P（P）*≤0.05 bt学生t吨测试）。

图7
体外和体内用病毒RdRp复合物的不同成分对DR1进行下拉分析。（A） HEK293T细胞与所指示的表达单个HA标记的病毒蛋白和Myc标记的DR1的质粒共转染。在转染后48小时收集细胞裂解物，并使用抗HA琼脂糖进行免疫沉淀（IP）。将所得产物进行蛋白质印迹。输入细胞裂解物显示在左侧面板中。（B） HEK293T细胞转染有或没有Myc-tagged DR1（DR1-Myc）48 h，然后在MOI为5的情况下感染IAV或不感染IAV 10 h。细胞裂解物通过使用与所示抗体结合的蛋白G-琼脂糖进行免疫沉淀。使用所示抗体对所得产物进行蛋白质印迹。输入细胞裂解物显示在左侧面板中。

图8
提出了IAV复制中DR1功能的模型。DR1在IAV复制中可能涉及以下双重机制：（i）DR1调节参与IFN产生和/或抑制宿主先天免疫的细胞基因的表达，为IAV复制提供有利环境；和（ii）DR1通过与病毒RdRp复合物相互作用，增强病毒聚合酶的催化活性或前体mRNA对cap摄取功能的供应，促进病毒RdR1活性。因此，DR1代表了IAV复制的一类新的宿主易感基因。问号表示有待调查的问题。

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1. Fouchier RA、Munster V、Wallensten A、Bestebroer TM、Herfst S、Smith D、Rimmelzwaan GF、Olsen B、Osterhaus AD.2005年。从黑头海鸥中获得的新型甲型流感病毒血凝素亚型（H16）的特征。《维罗尔杂志》79:2814–2822。doi:10.1128/JVI.79.5.2814-2822.2005。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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[1] Fouchier RA、Munster V、Wallensten A、Bestebroer TM、Herfst S、Smith D、Rimmelzwaan GF、Olsen B、Osterhaus AD.2005年。从黑头海鸥中获得的新型甲型流感病毒血凝素亚型（H16）的特征。《维罗尔杂志》79:2814–2822。doi:10.1128/JVI.79.5.2814-2822.2005。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Fouchier RA、Munster V、Wallensten A、Bestebroer TM、Herfst S、Smith D、Rimmelzwaan GF、Olsen B、Osterhaus AD.2005年。从黑头海鸥中获得的新型甲型流感病毒血凝素亚型（H16）的特征。《维罗尔杂志》79:2814–2822。doi:10.1128/JVI.79.5.2814-2822.2005。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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