不饱和脂肪酸诱导非标准自噬
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自噬诱导脂肪酸的筛选。 表达GFP-LC3的U2OS细胞在对照条件（Co）下培养，或用指示的饱和（黑色）或不饱和（蓝色）脂肪酸处理4小时，然后量化细胞质GFP-LC2的数量 + 自动荧光显微镜检测每个细胞的点数。 数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(* 对< 0.05, ** P（P）< 0.01与未经处理的细胞）。 棕榈酸酯、硬脂酸盐和油酸盐诱导的B–D自噬通量。 野生型（WT，C）和表达GFP-LC3的（B）U2OS细胞以及HeLa细胞（D）保持在对照条件下，暴露于无营养素（NF）条件下，或单独或与10μg/ml E-64d和10μg/ml胃蛋白酶抑制素（Pep）联合使用500μM油酸盐（OL）、500μM硬脂酸盐（ST）或500μM棕榈酸酯（PA）处理4（D）或6（B，C） h.此后，细胞质GFP-LC3的数量 + 每细胞点数（B）、LC3脂质化和p62降解（C）或标记的长寿命蛋白质降解（D）被量化。 在（B）和（D）中，数据是至少三个独立实验（B）的平均值±SEM（B）或归一化平均值±SD（D），或三个执行的代表性实验（D）的四个重复评估(* P（P）< 0.05, ** P（P）< 0.01与未处理细胞； ## P（P）< 0.01与仅用PA或OL处理的细胞相比； n.s.，与E-64d加Pep治疗的细胞相比无显著性差异）。 在（C）中，监测β-肌动蛋白水平，以确保车道荷载相等，并采用密度测定法量化脂质LC3（LC3-II）和p62的丰度（均归一化为β-肌动蛋白水平）。 E、 F ATG5和ATG7参与脂肪酸诱导的自噬。 用对照siRNA（siUNR）或靶向ATG5（siATG5）或ATG7（siATG 7）的siRNA转染WT（F）或GFP-LC3表达的（E）U2OS细胞48小时，并保持在对照条件下或用500μM PA或500μM OL处理。 6小时后，对细胞进行处理，以量化细胞质GFP-LC3的数量 + 自动荧光显微镜（E）或免疫印迹（F）评估LC3脂质化和p62降解。 在（E）中，数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(* P（P）< 0.05, ** P（P）< 0.01与未经处理的siUNR转染细胞相比； # P（P）< 0.05与仅用PA或OL处理的siUNR转染细胞相比）。 在（F）中，监测β-肌动蛋白水平，以确保泳道的负载相等。 G脂肪酸诱导小鼠自噬。 只向C57BL/6小鼠腹腔注射溶媒100 mg/kg PA或100 mg/kg OL。 一两个小时后，对动物进行安乐死，并通过免疫印迹法对指示组织中的LC3脂质过氧化、p62降解和AMPK磷酸化进行评估。 对GAPDH水平进行监测，以确保车道的荷载相等。 密度测定法用于量化脂化LC3（LC3-II）和p62（均标准化为GAPDH水平）和AMPK磷酸化（标准化为总AMPK水平）的丰度。 结果为三只小鼠的平均值±SD(* P（P）< 0.05, ** P（P）< 0.01*** P（P）< 0.001，与车辆处理小鼠相比）。
GFP-LC3的A–D Colocalization + 暴露于油酸盐的细胞中带有高尔基体的圆点。 表达GFP-LC3-或GFP-GALT/RFP-LC3的U2OS细胞保持在对照条件下（Co）或用500μM棕榈酸盐（PA）、500μM油酸盐（OL）或10μg/ml布氏菌素A（BFA）处理6小时。 随后，对细胞进行处理，以确定GFP-LC3之间的共定位 + 或RFP-LC3 + 点和TGOLN2（A）、GALT-GFP（B）、LMAN1（C）和RAB7A（D）。 数据是至少三个独立实验的标准化平均值±SEM(* P（P）< 0.05, *** P（P）< 0.001与未经处理的细胞）。 比例尺，10μm。
在接触油酸盐的细胞中，用高尔基体对自噬标记物进行A–C染色。 表达GFP-LC3的U2OS细胞保持在对照条件下（Co）或用500μM棕榈酸酯（PA）、500μM油酸盐（OL）处理6 h，可选择通过免疫金标记进行GFP-LC2和p62的差异检测，并通过透射电镜进行分析。 实心和空心箭头表示与抗p62（Ø=10 nm）和抗GFP（\216；=15 nm）抗体结合的金颗粒。 数据是至少三个独立实验的平均值±SD(* P（P）< 0.05时*** P（P）< 0.001与未经处理的细胞）。
brefeldin A对油酸诱导的高尔基体与自噬标记物共存的影响。 表达GFP-GALT/RFP-LC3的（A）、表达GFP-LC3的（B）或表达GFP-GALT-的（C）U2OS细胞在对照条件（Co）下培养或用500μM油酸盐（OL）单独处理或与10μg/ml布氏菌素A（BFA）联合处理6h。 此后，对细胞进行处理，以评估自噬标记物（GFP-LC3）的共定位 + 点和p62）和GFP-ALT + 结构。 数据是至少3个独立实验的标准化平均值±SEM(** P（P）< 0.01, *** P（P）< 0.001与未处理细胞； # P（P）< 0.05, ## P（P）< 0.01与OL处理的细胞）。 比例尺，10μm。 D、 E高尔基体分裂剂抑制油酸诱导的自噬。 野生型U2OS（D）或HeLa（E）细胞保持在对照或无营养（NF）条件下，或单独或与10μg/ml BFA联合使用500μM棕榈酸酯（PA）或500μM OL处理6小时。 此后，对细胞进行处理，通过免疫印迹（D）或长效蛋白降解（E）评估LC3脂质化和p62降解。 在（D）中，监测β-肌动蛋白水平，以确保车道荷载相等。 在（E）中，数据是所进行的三个代表性实验中一个实验的四个重复评估的标准化平均值±SEM（n.s.，无显著性** P（P）< 0.01与BFA给维持在控制条件下的细胞后的残留降解）。
A、 B AMPK、PKR、JNK1和CPT1A在棕榈酸诱导而非油酸诱导的自噬中的意义。 用对照siRNA（siUNR）或靶向AMPK（siAMPK）、PKR（siPKR）、JNH1（siJNK1）或CPT1A（siCPT1A）的siRNA转染表达GFP-LC3的U2OS细胞48小时，并保持在对照条件下（Co）或用500μM棕榈酸酯（PA）或500μM油酸盐（OL）处理。 六小时后，GFP-LC3 + dots通过自动荧光显微镜定量。 数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(* P（P）< 0.05时** P（P）< 0.01与未经处理的siUNR转染细胞相比； # P（P）< 0.05, ## 对< 0.01, ### P（P）< 0.001与经PA处理的siUNR转染细胞的比较； n.s.，与用OL处理的siUNR转染细胞相比，无显著性差异）。 比例尺，10μm。 C、 D棕榈酸诱导而非油酸诱导自噬的上游调节器。 将野生型（WT，D）和表达GFP-LC3（C）的U2OS细胞转染siUNR或BECN1（siBECN1）、PIK3C3（siPIK3C）和ULK1（siULK1）特异的siRNAs 48 h，并将其保存在控制条件下或用500μM PA或500μM OL处理额外6 h。 随后，对细胞进行处理，以量化GFP-LC3 + dots，或通过免疫印迹法评估LC3脂质化和p62降解。 在（C）中，数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(** P（P）< 0.01与未经处理的siUNR转染细胞相比； # P（P）< 0.05与PA处理的siUNR转染细胞相比； n.s.，与用OL处理的siUNR转染细胞相比，无显著性差异）。 比例尺=10μm。 在（D）中，监测β-肌动蛋白水平，以确保车道荷载相等，并采用密度测定法量化脂质LC3（LC3-II）和p62的丰度（均归一化为β-肌动蛋白水平）。 数据是至少3个独立实验的平均值±SD(* P（P）< 0.05, ** P（P）< 0.01与未经处理的siUNR转染细胞相比； # P（P）< 0.05与PA处理的siUNR转染细胞相比； n.s.，与用OL处理的siUNR转染细胞相比，无显著性差异）。 E–H PIK3C3抑制剂对棕榈酸和油酸诱导的自噬的影响。 在对照条件下培养表达GFP-LC3的U2OS细胞（E，F）和WT-HeLa细胞（G，H），将其保存在无营养（NF）培养基中，或单独或在5 mM 3-甲基腺嘌呤（3MA）或200 nM沃特曼（麦芽）的存在下，用指定浓度的PA（未指定的500μM）和OL（未指定）处理。 6小时后，对细胞进行GFP-LC3定量处理 + 点，用于通过免疫印迹（G）评估LC3A、LC3B和GABARAPL2的脂质化和p62降解，或用于评估长寿命蛋白质降解（H）。 在（E，F）中，数据是至少两个独立实验的平均值±SEM(** P（P）< 0.01与未经处理的细胞相比， # 对< 0.05, ## P（P）< 0.01, ### P（P）< 0.001相对于用PA处理的细胞； n.s.，与OL治疗的细胞相比无显著性差异）。 比例尺，10μm。 在（G）中，评估β-肌动蛋白水平以监测车道负荷，并使用密度测定法量化脂质化LC3-样蛋白（LC3A-II、LC3B-II和GATE16-II）和p62（均归一化为β-肌动蛋白水平）的丰度。 在（H）中，数据是来自三个执行的代表性实验中的一个代表性实验的四个重复评估的归一化平均值±SEM（n.s.，无显著性** 对< 0.01与保持在控制条件下的细胞服用3MA后的残留降解）。
A、 油酸盐对小鼠自噬流量的B Becn1非依赖性诱导。 野生型（WT）或 贝肯1 +/− 小鼠腹腔注射溶媒、100 mg/kg棕榈酸（PA）或100 mg/kg油酸（OL）。 四小时后，小鼠接受溶媒或15 mg/kg leupeptin（Leu）。 2小时后，对动物进行安乐死，然后进行免疫印迹辅助评估肝脏中LC3的脂质化和p62的降解。 监测β-肌动蛋白水平以确保车道荷载相等，并采用密度测定法量化脂质LC3（LC3-II）和p62的相对丰度，二者均归一化为β-肌动蛋白水平。 结果为2或3只小鼠的平均值±SD（n.s.，无显著性* P（P）< 0.05, ** P（P）< 0.01与相同基因型的未经治疗的小鼠相比； ## P（P）< 0.01与用相同脂肪酸治疗的相同基因型小鼠相比）。
酵母中油酸盐对Atg6非依赖性自噬的诱导。 指数增长WT或Δ atg6酿酒酵母 将细胞暴露于载体、1.8 mM棕榈酸酯（PA）或1.8 mM油酸盐（OL）中72 h，然后用免疫荧光显微镜辅助量化显示BODIPY的细胞 ®+ VPH1内的脂滴 + 液泡（调脂细胞）。 比例尺，5μm。 数据为4个独立实验的平均值±SEM(** P（P）< 0.01与载体处理的WT细胞相比； n.s.，不重要， # P（P）< 与用相同脂肪酸处理的WT细胞相比，0.05）。 驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。 油酸盐诱导线虫自噬的BEC-1依赖性。 A类 秀丽线虫 表达GFP:：LGG-1的菌株从L4级开始在仅含载物、500μM PA或500μM OL的平板上培养，并用 大肠杆菌 用空向量（EV）或BEC-1下调结构进行转换。 用次氯酸钠处理妊娠动物，GFP:：LGG-1的数量 + 通过荧光显微镜对释放胚胎中的dots进行定量。 比例尺，30μm。 数据为2个独立实验的平均值±SEM(*** P（P）< 0.001与用EV喂养并用车辆处理的蠕虫相比； n.s.，不重要， ### P（P）< 0.001与喂食EV并用相同脂肪酸处理的蠕虫相比）。
中的注释
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不饱和脂肪酸诱导的非标准自噬：异常？ 还是没有得到赏识？ EMBO J.2015年4月15日； 34(8):978-80. doi:10.15252/embj.201591392。 Epub 2015年3月11日。 EMBO J.2015。 PMID： 25762589 免费PMC文章。
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