Release of mitochondrial Opa1 following oxidative stress in HT22 cells

doi:10.1016/j.mcn.2014.12.007

.2015年1月：64:116-22。

doi:10.1016/j.mcn.2014.12.007。 Epub 2015年1月8日。

HT22细胞氧化应激后线粒体Opa1的释放

托马斯·桑德森¹, Sarita Raghunayakula公司², 与丽塔·库马尔^三

附属公司

¹韦恩州立大学医学院急诊科，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院心血管研究所，540 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院生理学系，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA。
²韦恩州立大学医学院急诊科，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA。
^三韦恩州立大学医学院急诊科，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院心血管研究所，540 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院生理学系，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA电子地址：rkumar@med.wayne.edu。

PMID： 25579226
预防性维修识别码：项目经理4429534
内政部： 2016年10月10日/j.mcn.2014.12.007

HT22细胞氧化应激后线粒体Opa1的释放

托马斯·桑德森等。分子细胞神经科学. 2015年1月.

.2015年1月：64:116-22。

doi:10.1016/j.mcn.2014.12.007。 Epub 2015年1月8日。

作者

托马斯·桑德森¹, Sarita Raghunayakula公司², 与丽塔·库马尔^三

附属公司

¹韦恩州立大学医学院急诊科，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院心血管研究所，540 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院生理学系，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA。
²韦恩州立大学医学院急诊科，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA。
^三韦恩州立大学医学院急诊医学系，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院心血管研究所，540 E.Canfield，Detroit，MI，USA；韦恩州立大学医学院生理学系，550 E.Canfield，Detroit，MI，USA电子地址：rkumar@med.wayne.edu。

PMID： 25579226
预防性维修识别码：项目经理4429534
内政部： 2016年10月10日/j.mcn.2014.12.007

摘要

参与多种神经退行性疾病的细胞机制集中在线粒体上，导致活性氧的过度产生，线粒体受损，随后细胞色素c释放。目前对线粒体动力学在神经退行性疾病氧化应激后细胞色素c释放中的作用知之甚少。在这里，我们用谷氨酸诱导HT22细胞系中的氧化应激，并研究线粒体动力学的关键介质，以确定该过程在氧化应激诱导的神经元死亡中可能发挥的作用。我们报告说，谷氨酸处理HT22细胞会导致活性氧（ROS）增加，线粒体融合蛋白Opa1释放到胞浆中，同时释放细胞色素c。此外，谷氨酸处理后，细胞信号的改变与线粒体断裂一致，线粒体断裂最终导致HT22细胞显著死亡。最后，我们报道了抗氧化剂生育酚的处理可以减弱谷氨酸诱导的ROS增加、线粒体Opa1和细胞色素c的释放，并防止细胞死亡。

关键词：细胞色素c；谷氨酸；HT22；线粒体动力学：线粒体；神经变性；氧化应激。

爱思唯尔公司出版。

PubMed免责声明

数字

**图1。谷氨酸治疗降低细胞增殖并诱导细胞死亡**
将HT22细胞置于96周的平板中，并用5mM谷氨酸处理。24小时后，与对照组相比，经5mM谷氨酸处理的细胞中MTT水平降低了5.5倍（p<0.0001）；与对照组相比，乳酸脱氢酶释放增加35.8倍（p<0.0001）。每组显示的数据为n=24。使用MitoSox探测线粒体ROS。暴露于5mM谷氨酸后，与对照组相比，谷氨酸处理的细胞中线粒体ROS显著增加8小时（p<0.05；C）。用SDS-PAGE分离等量的HT22细胞和大鼠初级神经元，并探测谷氨酸受体（NMDAR1亚单位）。所有实验中使用的HT22细胞均未显示谷氨酸受体（D）。

**图2。谷氨酸处理增加线粒体断裂**
将暴露于5 mM谷氨酸10小时的HT22细胞线粒体总形态与对照细胞进行比较。用针对ATP合酶（A）的一级抗体对线粒体染色后，根据线粒体总形态对细胞进行分类。含有管状和碎片状线粒体的细胞被标记为第1类，具有显性碎片状线粒体表型的细胞被标为第2类。在对照细胞中，82%的细胞具有混合的管状和碎片表型，而在5mM谷氨酸处理后，98%的细胞有显性的碎片线粒体表型（B）。

**图3。谷氨酸处理产生Opa1和细胞色素*c（c）*从线粒体释放到胞浆**
HT22细胞暴露于5mM谷氨酸4小时和10小时。对细胞进行分离，分离出细胞溶质和线粒体/重膜部分，并通过SDS-PAGE解析等量的蛋白质。用抗Opa-1和细胞色素抗体检测膜*c（c）*（A） ●●●●。谷氨酸处理10小时后，Opa-1（p<0.05；B）和细胞色素显著增加*c（c）*（p<0.05；B）与对照组相比。HT22细胞（C）的免疫荧光控制和5mM谷氨酸处理10小时，ATP合酶标记红色和细胞色素*c（c）*标记为绿色，DAPI标记为蓝色。我们在10小时内测量了对照组和5mM谷氨酸暴露细胞的细胞溶质和线粒体/重膜部分的Drp1水平。谷氨酸暴露10小时后，Drp1无明显变化（p<0.05；D）。

**图4。生育酚减弱谷氨酸处理后Opa1和细胞色素c的释放**
使用MitoSox超时测量线粒体活性氧。与谷氨酸暴露细胞相比，100μM生育酚可阻止5mM谷氨酸暴露后线粒体中ROS的积累（p<0.05；A）。生育酚还可以有效地保护线粒体形态，如对ATP合酶（绿色；B）的免疫荧光观察所示，并保持HT22细胞（C）的大体形态。HT22细胞单独暴露于5 mM谷氨酸或5 mM含100μM生育酚的谷氨酸中10小时。细胞被分为细胞溶质和线粒体/重膜组分。蛋白质在SDS-PAGE上解析，膜上探测Opa1和细胞色素*c（c）*水平。强效抗氧化剂生育酚可减弱Opa1和细胞色素*c（c）*释放到胞浆中，达到对照组水平（p<0.05；D）。

**图5。谷氨酸暴露导致caspase-3激活**
HT22细胞单独暴露于5 mM谷氨酸或5 mM含生育酚的谷氨酸中10小时。细胞被分为细胞溶质和线粒体/重膜组分。蛋白质在SDS-PAGE上进行解析，并在膜上探测裂解的caspase-3、bax、bcl-xl和bcl-2。在接触谷氨酸的细胞中，17kDa蛋白水解酶裂解的caspase-3显著增加（p<0.05；a），而对照组和生育酚处理的细胞中不存在。与对照组相比，Bax和Bcl-2水平没有变化（p<0.05；B&C），但与对照组比较，谷氨酸样品中的Bcl-XL显著降低（p<0.05；C）。

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