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临床试验
.2014年12月30日；9（12）：e115596。
doi:10.1371/journal.pone.0115596。 2014年电子收集。

MiR-29a通过靶向TGF-β活化激酶1结合蛋白1减少皮肤成纤维细胞产生TIMP-1，与系统性硬化的关系

马泽娜·齐埃科姆斯卡 1, 史蒂文·奥莱利 2, 莫妮卡·苏瓦拉 三, 卡塔日娜·博古妮娅·库比克 4, 雅各布·范·拉尔 5
附属公司
临床试验

MiR-29a通过靶向TGF-β活化激酶1结合蛋白1减少皮肤成纤维细胞产生TIMP-1，与系统性硬化的关系

马泽娜·齐埃科姆斯卡等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：系统性硬化症（SSc）是一种自身免疫性结缔组织病，其特征是由于细胞外基质（ECM）蛋白的积聚导致皮肤和内脏器官纤维化。金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）在ECM沉积中起关键作用。

目标：探讨miR-29a在系统性硬化皮肤成纤维细胞TAB1介导的TIMP-1生成调节中的作用。

方法：从皮肤活检中培养健康对照组（HC）和SSc成纤维细胞。使用ELISA、qRT-PCR和Western Blotting检测miR-29a转染后TIMP-1、MMP-1和TGF-β活化激酶1结合蛋白1（TAB1）的表达。胶原蛋白凝胶试验评估miR-29a对皮肤成纤维细胞的功能作用。此外，将萤火虫荧光素酶基因下游克隆的TAB1质粒3'UTR转染HeLa细胞以评估TAB1活性。HC成纤维细胞和HeLa细胞也转染靶向保护剂，以阻断内源性miR-29a活性。

结果：我们发现TAB1是miR-29a的新靶基因，也调节下游TIMP-1的产生。TAB1参与TGF-β信号转导，这是触发TIMP-1生成的关键细胞因子。为了确认TAB1是miR-29a的真正靶基因，我们使用了TAB1 3'UTR荧光素酶分析和靶保护系统。我们发现miR-29a不仅通过抑制TAB1减少TIMP-1的分泌，还增加了功能性MMP-1的生成，导致胶原蛋白降解。通过药物抑制或TAB1敲除阻断TAB1活性导致TIMP-1减少，证实了TAB1依赖性TIMP-1调节。miR-29a的增强表达能够通过下调胶原和TIMP-1逆转SSc成纤维细胞的纤维化表型。

结论：miR-29a抑制了皮肤成纤维细胞中TAB1介导的TIMP-1的生成，表明miR-29b可能是SSc的治疗靶点。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。miR-29a转染后col1A1和TIMP-1 mRNA和蛋白表达水平。
HC真皮成纤维细胞转染30 nM miR-29a，30 nM非靶向cont-miR或仅载体（untr）。转染后6 h和24 h测定Col1A1（A）、TIMP-1 mRNA（B）和TIMP-1蛋白分泌（C）。在转染24小时后和1µg/ml TLR4激动剂（LPS）治疗后（D），也测定TIMP-1蛋白水平。转染24小时后，对HC成纤维细胞的三个独立实验进行密度测定分析，并使用GAPDH作为负荷对照（D）。
图2
图2。miR-29a对HC成纤维细胞收缩特性的作用。
用30 nM miR-29a、30 nM cont-miR转染HC真皮成纤维细胞或用100 ng/ml外源性重组TIMP-1刺激HC真皮纤维细胞，24 h后通过胶原降解试验（A）评估HC真皮细胞的收缩特性，并测量胶原凝胶面积百分比（B）。在单层培养或接种在胶原凝胶上的未处理HC真皮成纤维细胞中测量MMP-1mRNA（C）。在存在miR-29a、cont-miR或重组TIMP-1（D）的情况下，在单层培养或接种在胶原凝胶上的HC真皮成纤维细胞中测定分泌的MMP-1水平。同样，在胶原凝胶上接种的HC真皮成纤维细胞中，在miR-29a、cont-miR或仅载体（untr）（E）存在的情况下，测量TIMP-1的分泌。
图3
图3。miR-29a与TAB1的3′UTR结合。
将300 ng 3′UTR TAB质粒（A）和30 ng肾素构建物在30 nM miR-29a、30 nM cont-miR或仅载体（untr）（B）存在下联合转染HeLa细胞。类似地，HeLa细胞与3′UTR TAB构建物和肾素在500 nM靶保护物结合到种子A-TP A或种子B-TP B或两者-TP A+B（C）的情况下共同转染。
图4
图4。靶向保护剂诱导HC皮肤成纤维细胞的纤维化表型。
将30 nM miR-29a、30 nM cont-miR和TAB1 mRNA（A）转染HC真皮成纤维细胞，24 h后检测蛋白（B）的表达。此外，用5 ng/ml TGF-β刺激HC皮肤成纤维细胞作为TIMP-1诱导的阳性对照。对四个独立实验进行了密度分析，并将GAPDH用作加载控制（B）。HC真皮成纤维细胞转染500 nM TP A、TP B，或在24 h后同时检测TP A+B和TIMP-1分泌。HC和SSc成纤维细胞（D）TAB1 mRNA的基础水平。
图5
图5。TAK1/TAB1抑制剂下调TGF-β刺激的HC皮肤成纤维细胞中TIMP-1的分泌。
在TGF-β刺激（5 ng/ml）之前，用分级剂量的Oxozeanol（TAK1/TAB1抑制剂）预处理HC真皮成纤维细胞2 h，并测量TIMP-1分泌和mRNA水平（A，B）。为了评估2µM Oxozeanol治疗后HC皮肤成纤维细胞的生存能力，进行了MTS分析（C）。HC真皮成纤维细胞转染100 nM抗TAB1或打乱寡核苷酸的siRNA，并在敲除（D，E）48小时后分析TAB1蛋白和TIMP-1分泌。
图6
图6。miR-29a逆转SSc皮肤成纤维细胞的表型。
比较HC和SSc成纤维细胞（A）的col1A1基础水平。用30 nM miR-29a、30 nM cont-miR转染SSc真皮成纤维细胞或用5 ng/ml TGF-β刺激SSc皮肤成纤维细胞，测定col1A1 mRNA水平（B）。HC和SSc真皮成纤维细胞转染30 nM miR-29a，30 nM cont-miR或用5 ng/ml TGF-β刺激，并测定分泌的TIMP-1（C）。miR-29a通过抑制HC和SSc皮肤成纤维细胞中的TAB1和TIMP-1在ECM调节中的作用示意图（D）。与HC成纤维细胞相比，SSc真皮成纤维细胞中TGF-β信号的激活增强导致miR-29a的下调，从而导致miR-29靶基因-TAB1的表达增加。
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