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.2014年12月18日；5（12）：e1573。
doi:10.1038/cddis.2014.526。

老龄小鼠心肌肌浆网线粒体钙交换缺陷

C费尔南德斯-桑斯 1, M Ruiz-Meana先生 1, E米罗-卡斯 1, 努涅斯 2, J卡斯特拉诺 1, M Loureiro先生 2, I芭芭 1, M蓬塞拉斯 1, 罗德里格斯-西诺瓦斯 1, J Vázquez先生 2, D加西亚-多拉多 1
附属机构

老龄小鼠心肌肌浆网线粒体钙交换缺陷

C费尔南德斯-桑斯等。 细胞死亡病. .

摘要

线粒体的改变与衰老过程中对疾病的易感性增加密切相关。我们研究了线粒体-肌浆网（SR）通讯在衰老过程中心肌细胞功能改变中的作用。老年小鼠（>20个月）和年轻小鼠（5-6个月）的心脏功能（超声心动图）和ATP/磷酸肌酸（核磁共振波谱）得到了保存。年轻和老年心脏线粒体的线粒体膜电位和静息氧耗量相似。然而，老年心脏纤维间线粒体中ADP刺激的最大O2消耗量显著降低。第二代蛋白质组学揭示了老年人线粒体蛋白氧化的增加。由于能量生产和氧化状态受线粒体Ca2+调节，我们研究了年龄对线粒体Ca2+摄取的影响。虽然在分离的线粒体中没有发现Ca2+摄取动力学的年龄依赖性差异，但老年心脏心肌细胞因SR Ca2+释放而产生的线粒体Ca2+摄取显著减少，这种影响与NAD（P）降低有关收缩活性增加时，H再生和线粒体ROS增加。免疫荧光和邻近连接分析发现，与Ca2+处理改变相关的老年心脏心肌细胞中线粒体电压依赖性阴离子通道和SR ryanodine受体（RyR）之间存在通信缺陷。在秋水仙碱破坏器官间细胞后，年轻心脏的心肌细胞中可以复制SR Ca2+向线粒体转移和Ca2+处理的年龄依赖性改变，其浓度对老年心肌细胞或分离的线粒体没有影响。因此，SR-mitochondria通信缺陷是细胞器间Ca2+交换效率低下的基础，导致老年心脏的能量需求/供应迷雾和氧化应激。

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数字

图1
图1
高龄对(一)β-半乳糖苷酶(b和c（c）)脂褐素自身荧光(d日和如果，绿色）溶酶体小泡(e（电子）和如果，红色）完整小鼠心肌细胞线粒体池标记(克)离体心脏线粒体中柠檬酸合成酶（CS）的活性(小时)线粒体产量是指从小鼠心脏分离出的肌下膜（SSM）和纤维间膜（IFM）线粒体中相对于心脏总蛋白的线粒体蛋白。平均值±S。E.M.来自n个=14–25次重复（5–10个心脏）
图2
图2
(一)年轻和年老小鼠完整心脏中的ATP/PCr，通过核磁共振波谱进行量化（左面板；n个=3个心脏）。在静息挫伤和DNP诱导最大线粒体去极化后，年轻和老年小鼠心脏完整心肌细胞的线粒体膜电位（JC-1比率荧光）（右图）。(n个=每组14–26个心肌细胞，5个心脏）。(b)休息O2消耗（状态-2）和ADP刺激的O2幼年（<6个月）和老年（>20个月）小鼠心脏肌下膜和纤维间线粒体的消耗（状态-3），由复合物1–4底物介导，由柠檬酸合成酶（CS）活性标准化。RCR，每个呼吸复合体的呼吸控制率（状态3/状态2）。平均值±S。E.M.来自n个=14–28次重复（5–10个心脏）
图3
图3
(一)老化对钙的影响2+瞬态振幅（面板1）和SR-Ca2+现场模拟的释放/吸收动力学（1 Hz）来自年轻和老年小鼠心脏（面板2至5）的含氟心肌细胞和总SR-Ca2+咖啡因刺激后的含量（第6组）。*，P（P）年轻人<0.05，n个=每组9–12个心肌细胞（6个心脏）。(b)年轻和老年小鼠心脏静态含氟心肌细胞中的自发火花频率、振幅、速率和扩散。半高宽，半高宽（μm）。**，P（P）<0.001（相对于年轻人）。数据表示平均值±S。1600个火花的E.M.（34个心肌细胞，4个心脏）
图3
图3
(一)老化对钙的影响2+瞬态振幅（面板1）和SR-Ca2+现场模拟的释放/吸收动力学（1 Hz）来自年轻和老年小鼠心脏（面板2至5）的含氟心肌细胞和总SR-Ca2+咖啡因刺激后的含量（小组6）。*，P（P）年轻人<0.05，n个=每组9–12个心肌细胞（6个心脏）。(b)年轻和老年小鼠心脏静态含氟心肌细胞中的自发火花频率、振幅、速率和扩散。半高宽，半高宽（μm）。**，P（P）年轻人<0.001。数据表示平均值±S。1600个火花的E.M.（34个心肌细胞，4个心脏）
图4
图4
(一)线粒体钙2+响应SR-Ca的整个时间摄取2+释放（10 mmol/l咖啡因，箭头）。N个=每组8–11个心肌细胞(n个=5个心脏）。(b)线粒体最大钙2+最大SR-Ca标准化摄取（rho-2）2+在年轻和老年小鼠渗透性心肌细胞中释放（fluo-4）。增加10 μmol/l Ru360（线粒体Ca的特异性阻断剂2+uniporter）阻止咖啡因诱导的线粒体钙2+两个年龄组的摄入，P（P）年轻人<0.05。n个=每组7-11个心肌细胞（5个心脏）。(c（c）)无年龄差异在体外线粒体钙2+将分离的肌下膜（SSM）和纤维间膜（IFM）心肌线粒体暴露于外部钙时的摄取动力学（CG5N荧光）2+脉冲为30 μmol/l（箭头）。添加10 μmol/l Ru360抑制线粒体Ca2+吸收。平均值±S。每组四个重复（六个心脏）的E.M。(d日)NAD（P）H/NAD（P）+比率2 1时电刺激后min Hz和5 Hz诱导年轻和年老小鼠心脏完整心肌细胞的高收缩活性（左面板），以及在5 Hz刺激（右侧面板）。数据表示平均值±S。E.M.（每组10–19个心肌细胞，9个心脏）。(e（电子）)左面板：青年和老年小鼠心肌组织中的总谷胱甘肽（GSHtot）和氧化谷胱甘苷（GSSG）水平。插图显示了氧化谷胱甘肽相对于总谷胱甘苷的分数；右侧面板：细胞溶质和线粒体ROS生成2 5点电刺激后min 通过DCF和MitoSox荧光定量，Hz诱导年轻和老年小鼠心脏完整心肌细胞的高收缩活性。插图显示了起搏期间线粒体短期ROS生成的动力学（箭头指示起搏5 Hz刺激）
图5
图5
(一)年轻和老年小鼠心肌细胞的共焦荧光图像同时标记有抗RyR（红色）、抗VDAC（绿色）和Hoechst（蓝色），分别用于显示SR、线粒体和细胞核。(b)老化对RyR–VDAC空间相互作用的影响，如曼德系数（m1）分析所量化，表示为RyR相对于总RyR荧光的百分比，与VDAC重叠（左面板）；在右侧面板中，显示RyR和VDAC荧光总量。平均值±S。每组4至6个心肌细胞（四个心脏）的E.M。(c（c）)用邻近连接分析（PLA）检测年轻和老年小鼠心脏分离的不同单个心肌细胞中RyR–VDAC相互作用的共焦荧光图像。正交叉反应性-反映了<40nm的分子间距离-用红色表示，原子核用蓝色表示（Hoechst）。(d日)衰老与RyR–VDAC交叉反应性导致的细胞荧光显著降低（左面板）和PLA分析定量的扩增点数量（右面板）相关。平均值±S。每组1071-3250个斑点的E.M.（15个心肌细胞，两个心脏）。(e（电子）)SR和线粒体Ca相关蛋白表达的Western blot代表带和定量2+年轻和老年小鼠的全心匀浆、微粒体和线粒体部分的运输和细胞器间通讯。用相应的参考蛋白对每个感兴趣的蛋白质进行标准化，如下所示：在总匀浆中，VDAC1/Grp75、Mfn2/GAPDH和Grp75/GAPDH；微粒体分数为Mfn2/VDAC1、VDAC1/Grp75、Grp75/GADPH和RyR/Grp75；在线粒体中，VDAC1/Grp75、Grp75/ANT1/2和Mfn2/ANT1/2。平均值±S。的E.Mn个=从四个心脏/组重复8次）
图6
图6
老化对以下方面的影响：(一)使用GELSILOX对线粒体相关膜（MAM；左）蛋白质和线粒体VDAC蛋白质中检测到的含半胱氨酸肽（右）进行定量氧化还原蛋白质组学。左图表示氧化（红色）或还原（蓝色）形式的含半胱氨酸肽的百分比。右表中的数字表示肽水平的标准化变量，如b; 负值表示老年小鼠心脏线粒体VDAC蛋白中含有氧化态Cys（Ox）或还原态Cys的肽增加（绿色），正值表示减少（红色）。(b)肌下膜（SSM）和纤维间膜（IFM）线粒体中线粒体呼吸复合物（1-5）的丰度。数据显示为所有氧化磷酸化蛋白质在蛋白质水平上标准化变量的累积分布（即以标准偏差单位表示的蛋白质的校正log2比率）。黑S形是理论零假设分布；向左移位表明蛋白质浓度增加。所有类别都非常接近于零假设分布，表明衰老不会影响线粒体呼吸蛋白的丰度。(c（c）)年轻和老年小鼠心脏SSM和IFM中氧化（红色）和还原（蓝色）含Cys肽丰度的变化。使用GELSILOX方法定量不同氧化状态下含有Cys残基的肽。对于所有含有氧化或还原Cys位点的肽（属于OxPhos复合物蛋白质），S形曲线表示肽水平上标准化变量的累积分布（即以S.D.为单位表达的肽的校正log2比率）
图7
图7
0.75的影响 μmol/l秋水仙碱：(一)通过曼德系数（m1）分析量化的RyR–VDAC空间相互作用，表明RyR的百分比（相对于总RyR）减少，与年轻心肌细胞中VDAC重叠，而对老年心肌细胞没有影响（左图）；和RyR–VDAC阳性交叉反应性通过邻近连接试验检测（PLA；右侧面板；n个=4–6). (b)钙的振幅2+氟-4负载心肌细胞接受场刺激的瞬态（左面板）和线粒体钙2+SR-Ca吸收2+洋地黄素透性心肌细胞释放（右图）。鲁360 10 μmol/l用于特异性抑制线粒体Ca2+单一搬运工(n个=6–11). (c（c）)体外线粒体钙2+暴露于外源性30 μ摩尔/升钙2+脉冲（箭头；顶部面板），复杂的11-介导O2消耗（状态-2）和ADP刺激的O2在缺乏秋水仙碱（对照组）或秋水仙素（底图）的情况下，通过柠檬酸合成酶活性标准化的幼鼠心脏SSM消耗量（状态-3）。平均值±S。每组四个重复（六个心脏）的E.M
图8
图8
衰老诱导心肌细胞SR-线粒体断裂的拟议机制示意图
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