Identification of c-MYC SUMOylation by mass spectrometry

doi:10.1371/journal.pone.0115337

.2014年12月18日；9（12）：e115337。

doi:10.1371/journal.pone.0115337。 2014年电子收集。

c-MYC磺胺酰化的质谱鉴定

曼普雷特·卡尔卡特¹, 陈柏基², 阿曼达·R·瓦西里申¹, 塔兰·斯里库玛², 山姆·S·金¹, 罗米娜·蓬齐埃利², 大卫·巴泽特·琼斯^三, 布莱恩·劳特¹, 琳达·Z·潘¹

附属公司

¹加拿大多伦多大学健康网络玛格丽特公主癌症中心；加拿大多伦多多伦多大学医学生物物理系。
²加拿大多伦多大学健康网络玛格丽特公主癌症中心。
^三加拿大多伦多儿童医院遗传学和基因组生物学项目。

PMID： 25522242
预防性维修识别码：项目经理4270761
内政部： 10.1371/新闻稿.0115337

c-MYC磺胺酰化的质谱鉴定

曼普雷特·卡尔卡特等。公共科学图书馆一号. 2014.

.2014年12月18日；9（12）：e115337。

doi:10.1371/journal.pone.0115337。 2014年电子收集。

作者

曼普雷特·卡尔卡特¹, Pak-Kei Chan先生², Amanda R Wasylishen女士¹, 塔兰·斯里库玛², 山姆·S·金¹, 罗米娜·蓬齐埃利², 大卫·巴泽特·琼斯^三, 布莱恩·劳特¹, 琳达·Z·潘¹

附属公司

¹加拿大多伦多大学健康网络玛格丽特公主癌症中心；加拿大多伦多多伦多大学医学生物物理系。
²加拿大多伦多大学健康网络玛格丽特公主癌症中心。
^三加拿大多伦多儿童医院遗传学和基因组生物学项目。

PMID： 25522242
预防性维修识别码：项目经理4270761
内政部： 10.1371/新闻稿.0115337

摘要

c-MYC转录因子是许多细胞过程的主要调节因子，这种癌基因的失调与50%以上的癌症有关。这种放松监管可以采取多种形式，包括改变翻译后监管。在这里，使用免疫沉淀结合质谱法，我们鉴定了MYC SUMO化位点（K326）。用精氨酸（K326R）取代通过该残基消除信号对MYC半衰期、细胞内定位、转录靶点以及两种不同细胞系统中MYC过度表达的生物学效应（评估软琼脂集落形成、增殖和凋亡）没有明显影响。虽然我们已经明确证明MYC SUMO化可以发生在K326上，但还需要进一步的工作来阐明SUMO酸化调节MYC的机制和生物学意义。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。蛋白酶体抑制后观察到MYC SUMO化。**
（A） MYC在变性条件下从用载体对照（DMSO）或MG132处理4小时的样品中进行免疫沉淀。SUMO2/3的免疫印迹显示，蛋白酶体抑制后，高分子量SUMO信号积累。（B） 293Tv细胞转染MYC和空载体（EV）对照或SUMO paralogs 1-3（S1、S2、S3）。24小时后，收集细胞并进行MYC免疫沉淀，然后进行免疫印迹以检测是否存在SUMO副产物。

**图2。MYC上SUMO站点的标识。**
（A） 293Tv细胞转染MYC和Flag-SUMO1。然后在变性条件下对细胞进行裂解，首先对MYC进行顺序下拉，然后对FlagSUMO1进行顺序下拉。对所得洗脱液进行质谱分析。（B）观察修饰（SUMO1）和靶（MYC）检测到的肽片段的序列。（C） MYC（靶标）和SUMO（修饰）的质谱裂解光谱，证明MYC在K326处发生SUMO化。（D）通过质谱观察到的MYC和翻译后修饰的图示。P：磷酸化，Ub：泛素化，B：碱性区，HLH-LZ：螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链，NLS：核定位信号。灰色框表示MYC家族蛋白之间的同源区域，称为MYC框（MBs）。

**图3。K326R突变体对MCF10A细胞的增殖和死亡无影响。**
（A） Western blot描绘了4-羟基三苯氧胺（4OHT）治疗24小时后，空载体对照（EV）、野生型（WT）和K326R细胞中MYC的相对表达水平。（B）用4OHT处理MCF10A细胞以诱导转基因表达。处理24小时后，用环己酰亚胺处理细胞，收集蛋白质并分析相对MYC表达和半衰期（n = 3). （C）将MCF10A细胞置于饥饿培养基中24小时，然后用4OHT处理24小时以诱导MYC表达。对细胞进行乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入染色，结果表明表达WT-和K326R-MYC的细胞可以刺激增殖，其程度与表达EV的细胞（n = 3，***p<0.001，使用Bonferroni的后验进行单因素方差分析）。（D）将MCF10A细胞饥饿24小时，然后用4OHT和衣霉素再处理24小时。将细胞固定并用碘化丙啶染色，测定G1前体细胞的百分比，表明WT-和K326R-MYC均能在相同程度上促进细胞凋亡，与EV对照组相比差异显著（n = 3; *p<0.05，**p<0.01，采用Bonferroni后验进行单因素方差分析）。

**图4。K326R突变体在SH-EP细胞中没有观察到表型效应。**
（A） Western blot描绘EV对照、WT-MYC和K326R-MYC的相对表达水平。肌动蛋白被用作加载控制。（B）软琼脂集落形成试验表明，WT和K326R MYC增强集落形成的能力（n = 4; *p<0.05**p<0.01；Bonferroni后测的单向方差分析）。（C）左面板：进行增殖试验，证明EV活性低于WT-和K326R-MYC（n = 3). 右侧面板：EV、WT和K326R表达细胞加倍时间。WT-和K326R-MYC的倍增时间与EV控制显著不同（n = 3，**p<0.01，使用Bonferroni后验进行单因素方差分析）。（D）细胞分馏显示WT-和K326R-MYC均定位于核室。层粘连蛋白B1被用作核区室（N）的标记，微管蛋白被用作胞质区室（C）的标记。

**图5。K326R突变体驱动转录激活和抑制的程度与WT-MYC相同。**
（A） Western blotting显示100 nM 4OHT治疗24小时后WT-和K326R-MYC的表达。肌动蛋白被用作加载控制。（B）核仁蛋白的双重荧光素酶分析(*NCL公司*)，一个激活的MYC靶点，揭示了WT和K326R MYC可以在相同程度上调节其表达（n = 3，p<0.001，Bonferroni后测的单因素方差分析）。（C）生长停滞和DNA损伤的双重荧光素酶分析45(*GADD45公司*)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(*CDKN1A公司*)，两个MYC抑制的靶点，显示WT-和K326R-MYC对这些靶点的抑制程度相同（n = 3，*p<0.05，Bonferroni后测的单向方差分析）。

**图6。WT-和K326R-MYC表现出类似的亚细胞定位。**
用DMSO（载体）或MG132处理SH-EP细胞4小时，对其进行MYC定位染色。MYC信号以红色显示，细胞核以蓝色显示（DAPI）。由于MYC在该细胞系中的内源性表达较低，空载体表达细胞对MYC的信号最小。WT-和K326R-MYC的异位表达显示出核信号。蛋白酶体抑制后，该信号保留在细胞核中，但出现点状染色。

**图7。K326R-MYC保留SUMO化**
用4OHT处理MCF10A细胞24小时以刺激转基因表达。然后，在收获和免疫沉淀MYC之前，用载体（DMSO）或MG132处理细胞4小时。对SUMO1和SUMO2/3进行免疫印迹分析，结果表明，蛋白酶体抑制后MYC的SUMO化增强。这种影响与下拉菜单（下面板）中的MYC量无关。

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1. Meyer N，Penn LZ（2008），《与MYC共度25年》。Nat Rev Cancer杂志8:976–990。-公共医学
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1. Pulverer BJ，Fisher C，Vousden K，Littlewood T，Evan G，et al.（1994）体内磷酸化残基对C-Myc共转化的位点特异性调节。癌基因9:59–70。-公共医学
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