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.2015年4月;21(7-8):1185-94.
doi:10.1089/ten。2018年4月20日下午。 Epub 2015年1月28日。

人羊水来源干细胞在纤维蛋白/聚乙二醇水凝胶中形成毛细血管样网络

附属公司

人羊水来源干细胞在纤维蛋白/聚乙二醇水凝胶中形成毛细血管样网络

奥马尔·贝纳维德斯等。 组织工程A部分. 2015年4月.

摘要

先天性出生缺陷组织工程策略的一个主要限制是无法在无血管支架中提供重要的氧气、营养和废物运输来源。成功的血管化需要可靠的方法来生成血管细胞和能够支持血管形成的支架。新生儿手术具有广泛的分化潜能、高增殖率和自体可用性,这使得羊水源性干细胞(AFSC)非常适合再生医学策略。AFSC-EC表达与内皮细胞相关的关键蛋白和功能表型。纤维蛋白基水凝胶在体外可刺激AFSC衍生的网络形成,但受到快速降解的限制。聚乙二醇(PEG)的加入提供了机械稳定性(第14天时重量保持率为65%±9%,纤维蛋白仅为0%),同时保留了纤维蛋白支架的主要优点,即快速形成(10±3 s)、生物相容性(88%±5%生存能力)和血管生成刺激。为了确定AFSC衍生微血管的可行性,我们将AFSC-EC作为血管细胞源,AFSC作为血管周围细胞源,分别与这些细胞类型的既定来源——人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和间充质干细胞(MSC)进行了比较。以4:1的内皮细胞与血管周细胞比率接种共培养物,并在37°C下培养凝胶2周。使用应力控制流变仪(G'=95±10Pa)进行机械测试,并根据形态评估细胞需要的水凝胶。根据血管厚度、长度、面积以及分支程度等关键参数分析网络形成。AFSC-EC和HUVEC的单个培养物在这些参数方面没有统计学差异,表明AFSC-EC的血管生成潜能;然而,强健血管的形成需要同时存在内皮细胞和血管周细胞源,并且在AFSC共培养中可以看到(与HUVEC/MSC相比,血管长度为70%±20%,血管面积为90%±10%,血管厚度为105%±10%)。在固定播种密度下,AFSC与AFSC-EC共培养对类似MSC的网络参数(150%导管长度、147%导管面积、150%导管厚度和155%分支)产生协同效应。这些结果表明,AFSC-EC和AFSC分别具有显著的血管生成和血管周生成潜力,适合体内评估。

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<b>图1</b>
图1。
未分化AFSC的特征。AFSC被分类用于c-kit+第2代培养至第5代,并进行分析。(A)光学显微镜显示类似MSC的纺锤状形态。比例尺为100微米。(B)流式细胞仪分析显示,AFSC对MSC标记物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105呈强阳性;ESC标记物SSEA4、Sox2和cMyc中度阳性;ESC标记Tra-1-60/81为负值。此外,这些细胞的亚群在整个传代过程中保持c-kit表达。(C)AFSC的标准G带核型显示为正常的二倍体男性核型。羊水来源干细胞;MSC,间充质干细胞。
<b>图2</b>
图2。
AFSC衍生内皮细胞(AFSC-EC)的评估。(A)血管内皮生长因子(VEGF)介导的c-kit分化示意图+AFSC转换为AFSC-EC。(B)AFSC-EC的流式细胞术分析显示,尽管干细胞标记物SSEA4、c-kit或CD44没有完全减少,但构成性内皮蛋白如CD31、VE-cadherin和VEGFR2的表达显著。分化细胞免疫标记物HLA-DR为阴性,HLA-ABC为阳性。此外,CD31人群+VE-cadherin和VEGFR2阳性细胞(16.4%)(右下面板).(C)镀膜AFSC-EC二维网络形成的荧光成像。肌动蛋白丝用指骨肽标记(绿色)用DAPI对细胞核进行复染(蓝色). 比例尺为100μm。在线提供彩色图像www.liebertpub.com/tea
<b>图3</b>
图3。
纤维蛋白/PEG水凝胶的表征。(A)纤维蛋白水凝胶在凝胶化后变得不透明,而纤维蛋白/PEG水凝胶保持半透明。(B)低浓度纤维蛋白原凝胶化时间(5mg/mL)溶液在37°C下的时间约为秒,而聚乙二醇化纤维蛋白原(0.5mg/mL PEG)明显较慢。高浓度纤维蛋白原(10mg/mL)和聚乙二醇化纤维蛋白原凝胶(1.0mg/mL聚乙二醇)。(C)14天后体外,仅在培养基中的高浓度纤维蛋白支架完全降解,而纤维蛋白/PEG水凝胶保持完整。(D)样品的剪切储存模量(G′)在50–150之间在任一给定浓度下,Pa.纤维蛋白/PEG水凝胶与纯纤维蛋白水凝胶相比均无显著软化,尽管高浓度纤维蛋白凝胶明显比低浓度纤维蛋白/PEG凝胶坚硬。(E)扫描电子显微镜图像显示,仅纤维蛋白水凝胶包含非常薄的纤维,而纤维蛋白/PEG水凝胶包含更大的捆绑结构。比例尺为10微米。(F)纤维蛋白水凝胶中的孔隙不均匀,主要孔隙轴和次要孔隙轴之间存在显著差异。纤维蛋白/PEG样品的总体孔径明显较小。(G、H)当仅比较纤维蛋白、纤维蛋白/PEG或Matrigel时,7天后AFSC的附着或存活率没有显著差异。值为第页<0.05(*)在所有测试中均被视为显著。聚乙二醇,聚乙二醇。在线提供彩色图像网址:www.liebertpub.com/tea
<b>图4</b>
图4。
纤维蛋白和纤维蛋白/PEG水凝胶内形成网络。AFSC、MSC、AFSC-EC、HUVEC和共培养物被播种和培养体外在内部(A)纤维蛋白治疗7天,(B)纤维蛋白/PEG持续7天,以及(C)纤维蛋白/PEG治疗14天。肌动蛋白丝用指骨肽标记(绿色)细胞核用DAPI复染(蓝色). 由于降解,第14天的样品中没有纤维蛋白(见图3C)。比例尺为100μm。在线提供彩色图像www.liebertpub.com/tea
<b>图5:</b>
图5:。
分析体外纤维蛋白/PEG水凝胶内形成网络。(A)肌动蛋白丝的荧光染色用于获得清晰的细胞轮廓并便于定量分析。AFSC-derived network hallodin染色(绿色)和DAPI(蓝色)然后使用AngioTool进行处理。比例尺为100μm。纤维蛋白/PEG水凝胶中石蜡包埋AFSC共培养切片用苏木精和伊红染色(B),比例尺为150微米)和αSMA/CD31(C),比例尺为50微米)评估管腔形成的可能性体外纤维蛋白支架染色粉红色和嵌入细胞染色深粉红色/紫色在选定区域,αSMA和CD31在嵌入细胞内的定位类似于未成熟毛细血管样结构。(D)AFSC人群(绿色)和AFSC-EC(红色)用膜结合染料预先封装标记,并在其增殖和通过纤维蛋白/PEG水凝胶迁移时进行跟踪。比例尺为100μm。收集的数据包括对(E)平均船舶长度,(F)厚度,以及(G)面积,以及(H)分支的程度。所有网络参数均归一化为HUVEC/MSC共培养。共享一个字母的横条彼此之间没有显著差异。值为第页<0.05在所有测试中均被视为显著。HUVEC,人脐静脉内皮细胞。在线提供彩色图像,网址为www.liebertpub.com/tea

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