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.2015年2月20日；290(8):4631-4646.
doi:10.1074/jbc。M114.613133。 Epub 2014年12月11日。

微管相关蛋白1（MAP1）促进人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）胞质内途径进入细胞核

朱丽叶·费尔南德斯 1, 德博拉·波提略 1, 安妮·丹卡特 2, 桑迪·穆尼尔 3, 安德烈亚斯·贝克尔 1, 帕斯卡·鲁克斯 2, 阿纳巴·赞博 1, 斯宾塞·肖特 2, 伊夫·雅各布 3, 皮埃尔·奥利维尔·维达兰 4, 皮埃尔·夏诺 5, 弗朗索瓦·克拉维尔 1, Nathalie J Arhel女士 6
附属公司

微管相关蛋白1（MAP1）促进人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）胞质内途径进入细胞核

朱丽叶·费尔南德斯等。 生物化学杂志. .

摘要

在细胞进入后，HIV通过微管和微丝向细胞核快速转运。细胞细胞质成分和病毒蛋白之间相互作用来调节转运尚未被确定。利用酵母双杂交筛选，我们确定了四种细胞骨架成分作为HIV-1 p24衣壳蛋白的假定相互作用伙伴：MAP1A、MAP1S、CKAP1和WIRE。指示细胞系和初级人类巨噬细胞中MAP1A/MAP1S的耗竭导致HIV-1感染性的显著降低，这是由于逆行运输受损，表现为衣壳在远离核膜的地方的特征性积累，以及核输入的整体缺陷。MAP1A/MAP1S不影响微管网络的完整性或细胞形态，但有助于微管的稳定，这一点之前已经证明有助于感染。此外，我们发现MAP1蛋白在体外和感染细胞中与HIV-1核心相互作用，并且相互作用涉及MAP1轻链LC2。MAP1蛋白的耗竭减少了HIV-1衣壳与动态和稳定微管的联系，表明MAP1蛋白有助于将传入的病毒衣壳连接到微管网络，从而促进细胞质运输。这项工作首次表明，在进入靶细胞后，HIV-1通过其p24衣壳蛋白与细胞骨架相互作用。此外，我们的结果支持MAP1蛋白通过刺激稳定微管的形成和介导HIV-1核心与微管的关联，在促进HIV-1高效逆行贩运中发挥作用。

关键词：细胞骨架；人类免疫缺陷病毒（HIV）；微管；运输；病毒学。

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数字

图1。
图1。
MAP1蛋白是高效HIV-1感染所必需的。P4-CCR5细胞被两种不同剂量的HIV-1感染（10和1ng的p24/孔）(A类)和VSV-G假型HIV-1（1和0.1ng的p24）(B). 通过48 hpi时的β-半乳糖苷酶活性评估感染性，并通过Bradford试验对每口井进行归一化。结果显示，重复进行的三个独立实验的平均值，无siRNA的脂质体感染和10 ng感染设置为100%。对于这一点，原始值平均为～300000相对光单位/秒。纳秒，不显著。C类用RT-PCR检测mRNA水平。
图2。
图2。
shRNA介导的MAP1A和MAP1S缺失导致HIV-1感染降低。 A类在人外周血单个核细胞中检测到内源性MAP1A和MAP1S转录物和蛋白质(中国人民银行)分别通过RT-PCR和Western blotting从健康献血者中提取。对于Western blotting，每孔加载约20μg蛋白质，对应约150000个外周血单核细胞。黑色，PCR空白对照。B和C类，细胞在m.o.i.50用shRNAs转导。使用RT-PCR在3 dpt时评估敲除效率(B)蛋白质条带定量的Western blotting（积分光密度，任意单位）(C类). 结果代表了三个独立的实验。D类，shRNA-转导的P4-CCR5细胞中的细胞存活率是通过MTT法检测活细胞中的线粒体活性来确定的。结果表明，以三份±S进行的两个独立实验的平均值。D。E类和F类，转导的P4-CCR5细胞感染了HIV-1(E类)或VSV-G伪型HIV-1(F类). 在感染后2天测定β-半乳糖苷酶活性。结果表明，两次独立实验的平均值为±S。D.NT控制设置为100%。对于这一点，原始值平均为～400000相对光单位/秒。
图3。
图3。
MAP1蛋白的消耗导致核进入的整体缺陷。P4-CCR5细胞在m.o.i.50时用shRNA转导，并在3dpt时用HIV-1 VSV-G感染。A–C24 hpi时，从感染细胞中提取DNA，进行定量，并进行定量PCR以评估LRT(A类)，2-LTR圆(B)和整合的前病毒(C类). 显示的结果是至少两个独立实验的平均值，以shLuc、扰码的百分比表示，共进行三次(可控硅)和NT对照样品。通过单因素方差分析评估统计显著性，并与对照样本进行多次比较。纳秒，不显著。***，第页< 0.001.D类，在感染后的特定时间点从感染细胞中提取DNA，并进行2-LTR和LRT-PCR。结果显示，进行了三次具有代表性的实验。
图4。
图4。
MAP1蛋白有助于HIV-1 RTC有效地转运到核膜。 A类，核周区域衣壳斑点自动检测算法概述。Acapella脚本被细分为三个目标子程序，依次分割细胞核、细胞质和细胞质中的衣壳斑点。从细胞核边缘制作一个厚度为1.2μm的掩模，以确定核周区域，在该区域中对斑点进行计数。比例尺表示10μm。B，用shRNAs转导P4-CCR5细胞，并在3 dpt时感染100 ng HIV-1 p24（LAI）。感染细胞固定在8 hpi，并用抗p24抗体标记。图像由LSM-700共聚焦显微镜采集。这个左侧面板显示衣壳信号右侧面板显示Hoechst、GFP（识别转导细胞）和衣壳重叠。比例尺表示10μm。C类，由两个输出定义的Acapella检测到的核周信号的量化：核周斑点数量/z切片的恒定数量(顶部面板)显示给定体积中所有单元相同的斑点数（z=4）；和核周斑密度(底部面板)显示每μm的斑点数3，从而考虑到每个细胞不同的细胞体积。每个点对应一个随机单元。使用单因素方差分析和Dunnett的多比较检验（***，第页≤ 0.001).
图5。
图5。
在缺乏MAP1蛋白的情况下，HIV-1 RTC向核膜转运的缺陷早在4 hpi和高达24 hpi时就可见。用shRNAs转导P4-CCR5细胞，并在第3天感染100 ng HIV-1 p24（LAI）。感染细胞在感染后的不同时间点（30分钟和2、4、8和24小时）固定，并用抗p24抗体标记。使用LSM700倒置显微镜采集图像，物镜×63，无变焦，帧大小1024×1024像素，平均两幅图像，扫描速度9。这个面板显示Hoechst和衣壳重叠。比例尺表示20μm。如图4图例所示，使用阿卡佩拉定量衣壳斑点/细胞的数量。图形表示核周区域检测到的斑点减去后的细胞质斑点数量，定义为围绕核膜的10像素厚度的掩模。数据表示为30分钟时细胞质斑点数的标准化分数，定义为每种情况下的病毒输入±S。D.使用非参数单向方差分析（Kruskal-Wallis）计算统计分析。NT样本不包括在分析中，因为GFP信号的缺失阻碍了细胞质检测（见图4A类).
图6。
图6。
MAP1蛋白有助于HIV-1在人原代巨噬细胞中的高效逆行运输。 A类巨噬细胞通过GM-CSF分化从血单核细胞中获得，用靶向候选siRNAs脂质体感染，并感染HIV-1。使用蔡司ApoTome×63物镜采集图像。比例尺指示10μm。B使用Cell Voyager旋转圆盘共焦仪获取转导和感染的原代巨噬细胞。采集Hoechst、GFP（shRNA-transfered cells）和Cy3（capsid labeling）中每种情况的图像。对阿卡佩拉检测到的核周信号进行量化，如B使用未配对的t吨测试（**，第页≤ 0.01).
图7。
图7。
MAP1A/MAP1S诱导人原代巨噬细胞微管稳定。 A类，MAP1A、MAP1S、CKAP1和WIRE的缺失不会导致细胞骨架完整性的丧失。用shRNAs转导P4-CCR5细胞，3dpt固定，并用抗微管蛋白抗体或罗丹明-阴茎肽标记。使用LSM700倒置显微镜采集图像。GFP表达为LV-shRNA的转基因，表明转导效率。比例尺表示20μm。B，对Acapella检测到的细胞体积进行定量。每个点对应一个随机细胞，表示细胞质(左侧面板)和核体积(右侧面板)单位：微米3使用Prism 6（GraphPad）（**，第页≤ 0.01).纳秒，不显著。C类，初级巨噬细胞在m.o.i.50转导shRNAs并感染HIV-1。制备6 hpi的细胞提取物，并通过Western blotting分析AC-MT、detyr-MT和EB1的表达水平。肌动蛋白被用作加载控制。图表显示了在三个不同供体±S中进行的五个独立实验的蛋白质带（ImageJ）的平均定量。E.公司。D类，用空白对照或LV-shRNA转导的P4-CCR5细胞用增加剂量的紫杉醇处理，并感染5 ng p24 HIV-1。图像显示对照组和1μ米紫杉醇处理的细胞。图表显示了Bradford标准化的平均三倍β-半乳糖苷酶值，表示为空白对照±S.E.的百分比，代表了2个独立实验。
图8。
图8。
MAP1A和MAP1S与HIV-1核心相互作用。 A类将MAP1A-LC2、MAP1S、CKAP1和WIRE融合到FLAG序列中，测试它们与用低浓度洗涤剂处理整个病毒后分离的HIV-1衣壳的相互作用。CypA和hnRNP E1分别构成阳性和阴性对照。B，p24与P4-CCR5细胞细胞质中的MAP1A相互作用。在m.o.i.50用shMAP1A转导P4-CCR5细胞并感染HIV-1。用Duolink邻近连接法检测p24和MAP1A之间的蛋白相互作用(红色圆点).比例尺表示5μm。使用Photoshop CS6进行量化，并使用Prism 6（GraphPad）进行统计分析。图表显示了五个随机场/条件±S中Hoechst染色细胞核的平均斑点数。E.（***，第页≤ 0.001).纳秒，不显著。C类和D类在m.o.i.50用shMAP1A转导原代巨噬细胞，并感染HIV-1和VSV-G-假型HIV-1。细胞固定在6 hpi，并用DNA特异性探针Hoechst进行三重染色(蓝色)，兔多克隆抗p24抗体(红色)和一种小鼠单克隆抗α-微管蛋白(C类)或乙酰化微管蛋白(绿色) (D类). 图像显示了具有代表性的数据。在控制单元中箭头表示HIV-1衣壳和微管之间的邻近事件，并以黄色箭头放大插图。比例尺表示5μm。
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