Regulation of caspase-3 processing by cIAP2 controls the switch between pro-inflammatory activation and cell death in microglia

doi:10.1038/cddis.2014.514

.2014年12月11日；5（12）：e1565。

doi:10.1038/cddis.2014.514。

cIAP2对胱天蛋白酶-3加工的调节控制小胶质细胞促炎激活和细胞死亡之间的转换

E卡瓦纳¹, J罗德¹, M A Burguillos先生¹, J L Venero公司², B约瑟夫¹

附属机构

¹瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所癌症中心肿瘤病理科，R8:03。
²西班牙塞维利亚塞维利亚大学和塞维利亚生物医学研究所（IBiS）法玛西学院生物科学与分子生物学系。

采购管理信息： 25501826
预防性维修识别码：项目经理4454160
内政部： 10.1038/cddis.2014.514

cIAP2对caspase-3处理的调节控制小胶质细胞促炎激活和细胞死亡之间的转换

E卡瓦纳等。细胞死亡病. 2014.

.2014年12月11日；5（12）：e1565。

doi:10.1038/cddis.2014.514。

作者

E卡瓦纳¹, J罗德¹, M A Burguillos先生¹, J L Venero公司², B约瑟夫¹

附属机构

¹瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所癌症中心肿瘤病理科，R8:03。
²西班牙塞维利亚，塞维利亚大学和塞维利亚生物医学研究所（IBiS），分子生物学部，农业学院。

采购管理信息： 25501826
预防性维修识别码：项目经理4454160
内政部： 2014年10月10日至2014年5月14日

摘要

小胶质细胞的激活、中枢神经系统的常驻免疫细胞以及炎症介导的神经毒性是神经退行性疾病的典型特征，例如阿尔茨海默病和帕金森病。caspase-3在小胶质细胞激活过程中发挥了一种意料之外的作用，通常被认为对细胞凋亡具有执行作用。这一发现产生的一个核心问题是，是什么阻止小胶质细胞激活过程中的胱天蛋白酶-3杀死这些细胞？半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活是一个两步过程，其中酶原首先被上游半胱氨酸蛋白酶如半胱氨酸水解酶-8裂解，形成中间产物，但仍具有活性的p19/p12复合物；此后，自动催化处理产生完全成熟的p17/p12形式的酶。在这里，我们表明，在小胶质细胞激活时诱导细胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）表达可阻止caspase-3 p19亚单位转化为p17亚单位，并在活性和亚细胞定位方面抑制caspase-2。我们证明，使用靶向cIAP2或SMAC模拟物（如BV6化合物）的小干扰RNA，对抗cIAP2-对caspase-3激活的抑制作用，可以减少小胶质细胞的促炎激活并促进其死亡。我们认为，小胶质细胞和潜在的其他细胞类型中不同的caspase-3功能存在于形成的活性caspase-3复合物中。这些结果也可能表明cIAP2可能是调节神经退行性疾病中观察到的小胶质细胞促炎激活和相关神经毒性的治疗靶点。

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数字

图1
促炎症激活的独特caspase-3处理模式与垂死的小胶质细胞。用1 μ24小时的LPS（g/ml） h或0.1 μ3人的M STS h分别促进促炎激活或细胞死亡。(一)免疫印迹分析表明，在LPS处理的小胶质细胞中，用裂解的caspase-3 Asp175抗体拉下后形成的免疫复合物中存在p19 caspase-2亚单位，该抗体可识别p17和p19亚单位。STS处理的小胶质细胞的免疫复合物包含p17和p19半胱天冬酶-3亚单位。(b条)亚细胞分馏说明了p19亚单位的局限细胞质定位，而p17亚单位在细胞质和核组分中都有定位

图2
LPS处理后，BV2小胶质细胞中cIAP2水平升高。(一)用qPCR检测未治疗组和6组大鼠cIAP1、cIAP2和XIAP的mRNA水平 h LPS处理的BV2小胶质细胞。(b条)通过免疫印迹分析所示时间点LPS诱导的cIAP2蛋白表达。iNOS表达被用作小胶质细胞促炎症激活和β-肌动蛋白用作蛋白质等负荷的标准。(**c（c）**)LPS处理的BV2细胞的cIAP2蛋白表达定量描述。数据表示为平均值±S。电子显微镜。；n个=3; **P（P）*< 0.05

图3
cIAP2与裂解的caspase-3相互作用调节p19向p17 caspase-2亚单位的转化、其酶活性和小胶质细胞的凋亡。(一)量化就地与未经处理的细胞相比，经LPS处理的BV2小胶质细胞中出现的裂解caspase-3 Asp175和cIAP2之间的PLA蛋白相互作用。数据以平均值±S表示。荧光点/细胞的E.M；n个=3; ****P（P）*< 0.001. (b条)描述了PLA在对照细胞和LPS处理细胞中的代表性图像。cIAP2和裂解的caspase-3 Asp175之间的相互作用显示为红点。(**c（c）**)亚细胞分馏说明了cIAP2的细胞质定位。(d日)免疫沉淀和随后使用抗裂解caspase-3 Asp175抗体的免疫印迹显示，cIAP2的选择性siRNAs敲低可促进LPS处理的BV2细胞中caspase-3p19到p17亚单位的转化。以非靶向siRNA作为对照。(**e（电子）**)免疫印迹密度分析显示裂解caspase-3的总水平和p17/p19比率。图示值是三个独立实验的平均值。每个条上方的值表示观察到的p17片段的百分比。发现cIAP2沉默后p19到p17转换增加具有统计学意义**P（P）*<0.05 (**（f）**)DEVD活性(克)抗裂解PARP、cIAP2和β-肌动蛋白和(小时)非靶向或cIAP2靶向siRNAs池击倒未经处理或LPS处理的BV2小胶质细胞后的细胞死亡定量。数据表示为平均值±S。电子显微镜。；n个=3;*P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01

图4
cIAP2沉默阻碍LPS治疗后小胶质细胞的促炎激活。使用siRNA敲低cIAP2表达可阻止LPS诱导的BV2小胶质细胞iNOS表达。(一)使用抗iNOS、抗cIAP2和抗肌动蛋白抗体的代表性免疫印迹。量化(b条)cIAP2和(**c（c）**)iNOS蛋白表达。(d日)iNOS和(**e（电子）**)通过qPCR评估未经治疗和LPS治疗的BV2小胶质细胞中IL-1βmRNA的表达水平，并用非靶向对照或cIAP2 siRNAs转导。数值为平均值±S。三个独立实验的E.M

图5
SMAC模拟物增强半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的激活并促进LPS激活的小胶质细胞的细胞死亡。BV2小胶质细胞，用1 μ24小时M BV6化合物 h、随后用1 μg/ml LPS，6次 h.STS（0.1 μM）用于3 h作为细胞死亡刺激物。(一)通过FACS分析评估cIAP2的表达。用BV6 SMAC模拟化合物预处理导致(b条)FACS分析和(**c（c）**)caspase-3活性（DEVD-ase活性）(d日)IL-1降低βmRNA表达和(**e（电子）**)通过LPS处理的BV2小胶质细胞中出现破碎、受损或浓缩的细胞核来监测细胞死亡。数据表示为平均值±S。电子显微镜。；n个=3; **P（P）*< 0.05; ***P（P）*<0.01

图6
说明cIAP2对caspase-3激活步骤及其生物功能的影响的方案。前caspase-3在Asp175被上游caspases（如活性caspases-8）裂解，生成中间但仍然活性的p19/p12复合物。此后，残基Asp28的自催化处理和从p19肽中去除短前体蛋白，生成p17/p12复合物，形成酶的完全成熟形式并转移到细胞核。反过来，p19/p12和p17/p12复合物可以分别裂解细胞质或细胞质/核细胞室中的底物，从而调节小胶质细胞的促炎症激活或凋亡细胞死亡。在促炎症刺激时，上调的cIAP2与caspase-3前体结合，并阻止p19到p17 caspase-3亚单位的转换

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