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.2015年1月30日；290(5):3121-36.
doi:10.1074/jbc。M114.628628。 Epub 2014年12月8日。

Pompe病导致人类诱导的多能干细胞源性心肌细胞Golgi糖基化缺陷

Kunil K Raval公司 1, 冉涛 2, 布伦特·E·怀特 2, 威廉·德兰格 三, 乍得·H·科昂 2, 于俊英 4, Priya S Kishnani公司 5, 詹姆斯·汤姆森 6, 迪恩·F·莫舍 7, 约翰·C·拉尔夫 三, 蒂莫西·坎普 8
附属公司

Pompe病导致人类诱导的多能干细胞源性心肌细胞Golgi糖基化缺陷

Kunil K Raval公司等。 生物化学杂志. .

摘要

婴儿型蓬贝病是一种常染色体隐性遗传病，由溶酶体糖原水解酶-酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）活性完全丧失引起，导致溶酶体糖原积聚和显著的心肌和骨骼肌病理改变。GAA活性丧失导致心肌病的机制尚不清楚。我们对婴儿型蓬贝病患者的成纤维细胞进行重新编程，以生成诱导的多能干细胞（iPS），并将其分化为心肌细胞（iPSC-CM）。Pompe iPSC-CMs没有检测到GAA活性和病理学糖原填充溶酶体。尽管如此，Pompe和对照iPSC-CM在工程化心脏组织中表现出类似的收缩特性。Pompe骨骼肌自噬受损；然而，对照组和Pompe iPSC-CM对LC3-II检测的自噬体的清除率相当。出乎意料的是，与对照iPSC-CM相比，来自Pompe iPSC-CMs的溶酶体相关膜蛋白LAMP1和LAMP2表现出更高的电泳迁移率。Brefeldin A诱导的对照iPSC CM中高尔基体的破坏再现了LAMP的高迁移率形式，表明Pompe iPSC CM产生缺乏适当糖基化的LAMP。等电聚焦研究表明，与对照iPSC-CM相比，LAMP2在Pompe中具有更碱性的pI，这主要是由于低唾液酸化。N-连接聚糖的MALDI-TOF-MS分析表明，多触角结构的多样性降低，Pompe iPSC-CM中主要存在三糖复合体聚糖前体。这些数据表明，庞培心肌病具有聚糖加工异常，因此与先天性糖基化障碍中观察到的肥厚型心肌病有相同的特征。

关键词：自噬；心肌病；高尔基；诱导多能干细胞（iPSC）；溶酶体糖蛋白；N-连接糖基化；庞贝病；组织工程。

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数字

图1。
图1。
从患者皮肤成纤维细胞重新编程的iPS细胞的特征。 A类用多能性的抗OCT4（核）和抗SSEA4（质膜）标记探测iPS细胞培养物的免疫荧光。比例尺=100μm面板和10μm插图。B类，各行Giemsa带核型图：对照1，46XX；庞培146XX；庞培2，46XY。C类iPS细胞畸胎瘤的H&E染色切片。内胚层、中胚层和外胚层的示例由每个重新编程的行表示。内胚层：对照1，类肝细胞；Pompe 1，原始肠上皮；Pompe 2，呼吸上皮。中胚层：对照1，软骨；庞培1，平滑肌；庞培2，软骨。外胚层：对照1，Pompe 1和Pompe 2，视网膜色素上皮。比例尺=50微米。
图2。
图2。
Pompe和对照iPS细胞系中的酸性α-葡萄糖苷酶基因型和生化表型。 A类，基因组DNA区域的PCR产物，包括公认会计准则Pompe 1、Control 1和Control 2 iPS细胞系的第18外显子在0.8%琼脂糖凝胶上分离。前18外显子18；型号ex18第18外显子缺失。B类，Pompe 2 iPS细胞基因组DNA的PCR产物在两个点突变位置的测序色谱图。下面对齐的野生型序列来自Control 2 iPS细胞。箭头指向一个等位基因中T核苷酸的缺失和G→其他等位基因的转换。对感兴趣的区域进行PCR扩增并直接测序。核苷酸位置编号请参阅公认会计准则cDNA序列。C类，用抗GAA探测iPS细胞总蛋白裂解物的免疫印迹。前体形式为～110 kDa，酶活性形式由暗带以上和a光带低于75-kDa标记。抗-GAPDH被用作负荷控制。D类，对四种iPS细胞系的总蛋白裂解物进行酶活性测定，以确定在pH4时将4-MUG水解为葡萄糖的能力，并在pH7时将荧光团4-MU水解为细胞质中性α-葡萄糖苷酶。活性以每小时释放4-MU的nmol/mg蛋白质进行测量。n个=每行4个生物复制品（取自不同传代的细胞）。全部误差线为±S。E.公司。
图3。
图3。
Pompe和控制iPSC-CM的超微结构。 A类在含有4.5 g/L葡萄糖的培养基中培养的对照1和Pompe 1 iPSC-CM的电子显微照片。比例尺=5微米B类成像前，对照1和Pompe 1 iPSC-CM在0 g/L葡萄糖中培养24小时的电子显微照片。比例尺=5微米C类，展开的区域来自B.比例尺=0.5微米。N个，细胞核；CG公司胞质糖原；M（M）线粒体；HL公司健康溶酶体；LG公司，溶酶体糖原；MF公司，肌丝；MF公司x个横截面为肌丝。
图4。
图4。
用对照和Pompe iPSC-CM生产的ECT的结构特征。 A类，试验前灌注室中ECT的照片。这个左端系在固定臂上右端很快就会连接到力传感器上。比例尺=1毫米。B类试验后H&E染色的纵向ECT切片的显微照片。比例尺=50微米C类，用抗cTnT免疫标记的ECT切片的免疫荧光图像，以确定心肌细胞的位置。比例尺=50微米。DAPI染色细胞核蓝色。D类，对照ECT的代表性电子显微照片。比例尺=5微米E类庞培ECT的电子显微照片。N个，细胞核；MF公司，肌丝；LG公司，溶酶体糖原。比例尺=5微米。
图5。
图5。
对照组和Pompe iPSC-CM产生的ECT的收缩力和动力学研究。 A类，力标准化为最大力(F类/F类最大值)与试验前在培养基中培养2周时，ECT以其固有速率（未经修饰）收缩2.5 Hz的单次收缩的时间曲线。每个ECT平均收缩30次。B类，的F类/F类最大值 与对照组和Pompe ECT在2.5 Hz下测得的时间曲线要么允许在培养基中以其固有频率收缩2周，要么在测量前以2.5 Hz的频率起搏1周。表3给出了起搏组和固有频率组中每个细胞系的N（测试的ECT数）。C类,F类/F类最大值 与在培养基中以2.5 Hz频率起搏1周的ECT，以2.5 Hz的频率进行单次收缩的时间曲线。D类，一阶导数（dF类/d日t吨，dt=0.001s）F类/F类最大值与时间曲线C类.全部误差线为±S。E.公司。
图6。
图6。
从CQ介导的溶酶体停滞恢复期间，对照和Pompe iPSC CMs中的自噬体流量。 A类CQ治疗2天前后，对照组和Pompe iPSC-CM中LC3的免疫荧光图像。DAPI染色细胞核蓝色。比例尺=10微米。B类在CQ治疗和GAPDH对照恢复期间总蛋白裂解物的LC3免疫印迹。LC3-I在自噬体形成后转化为LC3-II。每个细胞系显示了三个重复实验（CMs从不同的iPS细胞传代分化而来），其中一个是车道很好地代表了一个培养基中的细胞。D0，第0天。在CQ处理之前立即收获细胞。CQ公司细胞在蛋白采集前暴露于CQ 2天。R1级,R4型、和R8级，从CQ治疗中恢复。从培养基中取出CQ，并在收获前在正常培养基中培养细胞1、4和8天。这个x个轴标记为与免疫印迹时间点对应。C类，LC3-II/GADPH密度比的量化B类相对于设置为1的最大比率。每个x个轴标记表示1天，其中黑色条表明CQ暴露。D类来自对照1和2以及Pompe 1和2 iPSC-CM总蛋白的p62和总泛素化蛋白（单和多）的免疫印迹。E类p62和共轭泛素的定量(Conj-Ub公司)GAPDH密度比。将四个独立对照（两个C1+两个C2）和Pompe（两个P1+两个P2）样品在两个单独的印迹上的密度比平均化。全部误差线为±S。E.公司。
图7。
图7。
CQ治疗前后对照组和Pompe iPSC-CM的LAMP分析。 A类、对照组和Pompe iPSC-CM中的LAMP1免疫荧光(D0)CQ治疗2天后(Tx（发送）). DAPI染色细胞核蓝色。比例尺=10微米。B类CQ治疗2天前后，Pompe和对照iPSC-CM的LAMP1免疫印迹。数据一式两份。C类CQ暴露2天前后，Pompe和对照iPSC-CM的LAMP2免疫印迹。
图8。
图8。
高尔基体结构破坏和人工溶酶体储存障碍诱导对来自对照组和Pompe iPSC-CM的LAMP1和LAMP2的影响。 A类高尔基体被顺式-和反式-对照组和Pompe iPSC-CM中以及治疗后的高尔基体标记物GM130和高尔基体-97(Tx（发送）)与BFA合作。比例尺=10微米。B类未经处理的iPSC-CM的LAMP1和LAMP2免疫印迹(无Tx)500 ng/ml BFA处理2天后和100 m培养2周后米蔗糖(S公司). GAPDH起到装载控制的作用。C类在对照2 iPSC-CM中，蔗糖处理2周前后，溶酶体用LAMP1染色。比例尺=10微米。所有细胞核均用DAPI染色蓝色。D类皮肤成纤维细胞的代表性LAMP1和LAMP2免疫检测(FB公司)和iPS细胞总蛋白裂解物。
图9。
图9。
通过内切糖苷酶处理和二维糖蛋白分离对来自对照组和Pompe iPSC-CM的LAMP2进行糖基化分析。 A类，对照2和Pompe 2 iPSC-CM中LAMP2的内切糖苷酶分析。Endo F可全部切割N个-连接的聚糖链，产生de-N个-糖化肽。Endo H劈理N个-尚未被高尔基糖苷酶的α-甘露糖苷酶II类处理的连接聚糖链。B类Western blot显示，通过WGA糖蛋白下拉，LAMP2从iPSC-CM总蛋白中富集。从等量的对照2和Pompe 2总细胞蛋白中免疫检测LAMP2(输入)和WGA结合糖蛋白(wga公司).C类Western blot显示WGA从对照1 iPSC-CM总蛋白裂解物中提取LAMP2的效率。在WGA结合组分和WGA未结合组分（流通）中免疫检测LAMP2和GAPDH(英尺))分数。D类、对照1和2以及Pompe 1和2 iPSC-CM的WGA-结合糖蛋白提取物分别通过pI和分子量沿水平和垂直轴分离，并探测LAMP2。通过使用三个空白IEF管的表面pH电极测量IEF管上的pH梯度。还包括在LAMP2的二维分离和免疫检测之前经唾液酸酶处理的对照1和Pompe 1糖蛋白。*，表示可能的背景检测。
图10。
图10。
的质谱N个-来自对照1和Pompe 1 iPSC-CM的链接聚糖。MALDI-TOF-MS获得的质谱N个-来自对照1的链接聚糖(A类)和庞培1(B类)iPSC-CM。每个样品处理等量（称重）的总细胞蛋白N个-交联聚糖提取、透甲基化和质量/电荷测定。将单个峰和背景强度校准为样品的最大强度峰。包含相对较低强度峰值的区域在未放大的区域上方以4倍放大率显示。
图11。
图11。
的质谱N个-来自对照2和Pompe 2 iPSC-CM的链接聚糖。MALDI-TOF-MS获得的质谱N个-来自对照2的链接聚糖(A类)和庞培2(B类)iPSC-CM。描述见图10图例。
图12。
图12。
对照组和Pompe iPSC-CM中的糖基化不良和层粘连蛋白结合。 A类，两个对照组糖蛋白的免疫印迹(C1类和指挥与控制)和庞培(第1页和第2页)iPSC-CM用抗αDG抗体IIH6c4和VIA4-1进行探测，这些抗体专门检测层粘连蛋白结合糖表位。每个车道在一个细胞系内代表来自不同iPS细胞传代的iPSC-CM的蛋白质。B类，层粘连蛋白重叠分析，以测量层粘连素与αDG的特异性结合能力。层粘连蛋白的结合发生在IIH6c4和VIA4-1识别的αDG分子量处。C类，α/β营养不良聚糖比率的量化A类和层粘连蛋白结合βDG比率D类。对照组和Pompe组之间未发现显著差异。D类和E类与外源性层粘连蛋白孵育2天后，iPSC-CM的层粘连素和αDG（IIH6c4）免疫荧光被固定(最下面一行)与正常培养条件相比(顶行)控制2中(D类)和庞培2(E类)iPSC-CM。比例尺=20微米。所有细胞核均用DAPI染色蓝色.
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