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.2014年12月6日；16(6):491.
doi:10.1186/s13058-014-0491-x。

孕酮受体激活通过转录抑制和增加蛋白质转换下调GATA3促进乳腺肿瘤生长

弗兰科·伊佐 1, 佛罗伦西亚·梅尔科利亚诺 2, 莱安德罗·文图鲁蒂 三, 梅赛德斯-特卡奇 4, Gloria Inurrygarro公司 5, 罗克萨娜·席拉奇 6, 莱安德罗·塞尔切蒂 7, 帕特里夏·埃利萨德 8, 塞西莉亚·J·普罗埃蒂 9
附属公司

孕酮受体激活通过转录抑制和蛋白质周转增加下调GATA3，促进乳腺肿瘤生长

弗兰科·伊佐等。 乳腺癌研究. .

摘要

简介：转录因子GATA3参与乳腺发育，对维持管腔上皮细胞的分化状态至关重要。GATA3在乳腺癌中作为抑癌剂的作用已经确立，尽管仍需要深入了解GATA3表达缺失的机制。

方法：采用染色质免疫沉淀法研究孕激素对GATA3启动子转录因子募集的调节。我们通过western blot和反向RT-qPCR实验分别探讨孕激素对GATA3蛋白和mRNA表达的调节。共聚焦显微镜和体外磷酸化研究用于检测孕激素在其308残基中诱导GATA3丝氨酸磷酸化的能力。在体外增殖和体内肿瘤生长实验中，研究了GATA3参与孕激素诱导的乳腺癌生长。

结果：在本研究中，我们证明孕激素激活的孕酮受体（PR）通过调节乳腺癌细胞中的转录和翻译后水平来降低GATA3的表达。在前一种机制中，zeste同源物2的组蛋白甲基转移酶增强子与激活的PR共同征募到GATA3近端启动子中假定的孕酮反应元件，增加H3K27me3水平并诱导染色质致密化，导致GATA3 mRNA水平降低。这种转录调控与通过孕激素诱导的丝氨酸308处的GATA3磷酸化以及26S蛋白酶体介导的降解增加GATA3蛋白周转有关。PR激活后，这两种分子机制共同降低乳腺癌细胞中GATA3的表达水平。此外，我们证明，孕激素诱导细胞周期蛋白A2上调需要降低GATA3水平，而细胞周期蛋白A1介导细胞周期的G1至S期转变，据报道与乳腺癌预后不良有关。最后，我们表明，孕激素刺激体外细胞增殖和体内肿瘤生长都需要下调GATA3。

结论：在本研究中，我们揭示了孕激素诱导的PR激活通过转录和翻译后调节导致乳腺癌细胞中GATA3表达缺失。重要的是，我们证明了GATA3下调是孕激素诱导细胞周期蛋白A2上调和孕激素诱导体外和体内乳腺癌细胞生长所必需的。

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数字

图1
图1
PR激活促进GATA3下调。A）T47D、BT474或C4HD细胞用或不用抗菌素RU486（10 nM）预处理30分钟，然后在指定的时间内与MPA（10 nM）混合。制备总蛋白裂解物，用western blot（WB）检测GATA3的表达。对GATA3条带进行密度测定，并将值归一化为GAPDH蛋白条带，将未处理细胞的值设置为1.0。B）用对照siRNA或靶向PR的siRNA（siRNA PR）转染T47D、BT474或C4HD细胞。将细胞饥饿24小时，并用MPA处理指定的时间，制备总蛋白裂解物，并通过WB测量GATA3的表达。如图A所述对条带进行量化。C）用MPA处理转染PR-A（T47D-YA）或PR-B（T44D-YB）亚型的T47D细胞、PR-null T47D-Y细胞或T47D-Y细胞18小时。根据面板A、MPA、醋酸甲羟孕酮中的描述对带状物进行量化；PR，孕酮受体。
图2
图2
PR和EZH2联合招募对GATA3基因的转录抑制。A）蛋白质补充GATA3协议用ChIP分析所示处理细胞中的启动子。使用位于−1504 bp处的潜在PRE侧翼的引物，通过q-PCR扩增免疫沉淀DNA。将每个样本归一化为输入。数据表示为同型对照的n倍染色质富集。B）按照A所述处理T47D或T47D-Y-C587A细胞并进行ChIP。C）首先用PR抗体免疫沉淀T47D细胞的染色质，然后用EZH2抗体重新免疫沉淀。还显示了反向免疫沉淀顺序。免疫沉淀DNA的q-PCR分析如A所述。D）按指示处理的T47D细胞的核提取物用PR抗体进行免疫沉淀（IP），并用EZH2抗体进行WB分析。作为特异性的控制，用同种对照物对裂解产物进行免疫沉淀。输入细胞裂解物被平行印迹。E）使用附加文件1表S1中详细说明的指定引物，按照方法一节所述进行DNAse敏感性分析。F）按照指示处理T47D或T47D-Y-C587A细胞，并通过RT-qPCR测定GATA3 mRNA表达水平。通过将GATA3 mRNA的绝对水平归一化为GAPDH水平（作为内部对照），并将未处理细胞的值设置为1.0，计算MPA处理指定时间后mRNA表达水平的倍数变化。对于A、B、C和F(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001，单因素方差分析）。G）孕激素诱导GATA3转录抑制机制的示意图。方差分析；ChIP，染色质免疫沉淀；EZH2，zeste同源物2的增强子；MPA，醋酸甲羟孕酮；孕酮受体；PRE，孕酮反应元件；WB、Western blot。
图3
图3
GATA3通过26S蛋白酶体的翻译后调节。A）用MPA处理T47D-Y-C587A细胞18小时，制备蛋白质细胞裂解物并对所指示的蛋白质进行免疫印迹。通过密度计分析WB中GATA3条带的信号强度，将值标准化为GAPDH蛋白条带，将未处理细胞的值设置为1.0。B）在指定的时间内，用MPA和/或放线菌素D（5μg/μl）处理或不处理T47D细胞。通过将GATA3 mRNA的绝对水平归一化为GAPDH水平（作为内部对照），并将未处理细胞的值设置为1.0，计算MPA处理指定时间后mRNA表达水平的倍数变化。不显著（NS），单向方差分析。C）如图所示，无论是否使用最终浓度为1μM的环己酰亚胺（CHX）和/或最终浓度为100 nM的MPA或硼替佐米（Btz）处理T47D细胞，制备蛋白细胞裂解物，并用WB测量GATA3的表达。分析WBs中GATA3条带的信号强度，如A所示。D）T47D细胞用Btz预处理或不处理30分钟，然后按指示用MPA处理或不使用MPA处理，用RT-qPCR测定GATA3 mRNA表达，如B(***P（P）<0.001，单因素方差分析）。E）如图所示，用MPA和/或Btz处理或不处理T47D细胞，制备蛋白细胞裂解物，并用WB测定GATA3的表达。分析WBs中GATA3条带的信号强度，如A.ANOVA所示，方差分析；MPA，醋酸甲羟孕酮；WB、Western blot。
图4
图4
GATA3磷酸化调节蛋白质稳定性。A）用MPA和PKA抑制剂PKI（1μM）处理或不处理T47D细胞8小时。细胞核用碘化丙啶染色，并进行共焦显微镜分析。比例尺 = 10微米。右侧面板：在A中进行的治疗中pSer308-GATA3阳性细胞的量化。对于每个治疗中至少150个细胞（N = 6) (**P（P）<0.01***P（P）<0.001，单因素方差分析）。B）PKA诱导pSer308-GATA3在体外对按指示处理的T47D细胞进行裂解，并从每个细胞处理的蛋白提取物中免疫沉淀PKA。在（D）MEM中生长的T47D细胞免疫沉淀GATA3。免疫沉淀的GATA3受到感冒在体外方法一节中所述的磷酰化分析。C）通过碘化丙啶染色确定的细胞周期不同阶段pSer308-GATA3的共焦显微镜图像。比例尺 = 10微米。右侧面板上的条形图表示由DNA含量确定的细胞周期不同阶段的pSer308-GATA3平均荧光强度（MFI）的流式细胞术分析(***P（P）<0.001，学生t吨-测试）。D）T47D细胞用CHX和/或MPA或H89（1μM）处理指定时间。WBs的GATA3条带进行了密度测定，并将值归一化为GAPDH蛋白条带，将未处理细胞的值设置为1.0。结果以线形图表示。E）用所示载体转染细胞48小时，饥饿24小时，并按所示处理。WB的密度分析与D中一样进行。F）如实施例E转染细胞，如实施例D进行密度测定分析。G）孕激素对GATA3翻译后调节的建议模型。方差分析；CHX，环己酰亚胺；MPA，醋酸甲羟孕酮；蛋白激酶；WB、Western blot。
图5
图5
孕激素诱导的细胞增殖和细胞周期蛋白A2水平升高需要GATA3下调。A）用所示载体转染T47D细胞48小时，并按照方法部分所述测量细胞增殖。不显著（NS）(***P（P）<0.001，单因素方差分析）。B）用MPA处理细胞指定时间，制备蛋白裂解物并对指定蛋白进行免疫印迹。通过将细胞周期蛋白A归一化为GAPDH蛋白带并将未处理细胞的值设置为1.0，获得密度测定值。C）用所示载体转染细胞48小时，饥饿24小时，并按所示处理。制备蛋白裂解物并对所示蛋白进行免疫印迹。根据面板B的描述对条带进行量化。方差分析；MPA，醋酸甲羟孕酮。
图6
图6
孕激素诱导的GATA3下调是必需的 体内 肿瘤生长。A）C4HD电池（106)将每个实验组的小鼠皮下接种到经或未经MPA处理的雌性BALB/c小鼠（n = 每个实验组6个），并使用公式W计算肿瘤体积2x L/2，其中W = 宽度和L = 长度。箱线图表示每个实验组获得的生长曲线下面积的值(***P（P）<0.001和**P（P）<0.01，单因素方差分析）。B）从肿瘤样品中制备蛋白质提取物，并对所示蛋白质进行免疫印迹。C）GFP、GFP-GATA3-WT和GFP-GACA3-S308A C4HD肿瘤中细胞周期蛋白A2的免疫组织化学研究。使用人类正常乳房组织作为阴性对照（下图）。显示了每个实验组的代表性图像。比例尺 = 20微米。方差分析；MPA，醋酸甲羟孕酮。
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