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.2015年2月：79:212-23。
doi:10.1016/j.yjmcc.2014.11.008。 Epub 2014年11月22日。

转基因过表达丝裂原蛋白减轻糖尿病蜂窝织炎相关心脏和线粒体功能障碍

达伦德拉·塔帕 1, 科迪·尼科尔斯 1, 萨拉·刘易斯 1, 丹妮尔·谢泼德 1, 拉贾加纳帕提·贾甘纳森 1, 塔拉·克罗斯顿 1, 凯文·特维特 2, 安东尼·霍尔顿 2, 沃尔特·巴斯勒 1, 约翰·霍兰德 三
附属公司

转基因过表达丝裂原蛋白减轻糖尿病蜂窝织炎相关心脏和线粒体功能障碍

达伦德拉·塔帕等。 J Mol Cell心脏病学. 2015年2月.

摘要

丝裂霉素，也称为心肌蛋白，是一种线粒体内膜结构蛋白，在维持嵴形态和结构方面起着核心作用。它是线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）复合体的关键组成部分，对线粒体结构和嵴形态至关重要。我们实验室以前曾报道过1型糖尿病期间线粒体形态和蛋白质组组成的改变，其中丝裂原在纤维间线粒体（IFM）中显著下调。本研究的目的是研究丝裂原过表达是否可以通过恢复线粒体形态和功能来限制与糖尿病心脏相关的线粒体断裂。产生过表达有丝分裂素的转基因小鼠系，并使用多剂量方法向小鼠腹膜内注射链脲佐菌素。糖尿病发病五周后，评估心脏收缩功能。与野生型对照组相比，米托菲林糖尿病小鼠的射血分数和缩短分数得到恢复（两者均P<0.05）。在1型糖尿病IFM中观察到的电子传递链（ETC）复合物I、III、IV和V活性、状态3呼吸、脂质过氧化以及线粒体膜电位的降低在米托菲林糖尿病小鼠中得到恢复（均P<0.05）。电子显微照片的定性分析显示，与野生型对照组相比，米托菲林糖尿病小鼠线粒体嵴结构恢复。此外，使用流式细胞术测量线粒体内部复杂度显示，糖尿病IFM的内部复杂度显著降低，而米托菲林糖尿病IFM恢复了这种降低（P<0.05）。综上所述，这些结果表明，转基因过表达丝裂原蛋白保留了线粒体结构，导致糖尿病心脏线粒体功能恢复和心脏收缩功能障碍减弱。

关键词：糖尿病；电子传输链；线粒体；米托菲林。

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数字

图1
图1。丝裂原转基因构建和蛋白表达示意图
（A） 通过将人丝裂原cDNA作为SgfI和XhoI片段插入pCAGGS的XbaI和XhoI克隆位点，并通过SspI和BamHI消化释放，实现了丝裂原转基因小鼠的生成。分离（B）SSM和IFM线粒体中丝裂原蛋白表达的Western blot分析。通道1-2为对照，通道3-4为丝裂原转基因，通道5-6为SSM和EFM线粒体的丝裂原基因转基因糖尿病样品。（C）SSM与IFM线粒体蛋白水平的条形图表示。（D） Western blot分析对照组（1-2通道）和丝裂原转基因（3-4通道）小鼠心脏线粒体中丝裂原蛋白的表达。COX IV、GAPDH和胭脂红染色用作印迹的负荷控制。数值表示为平均值±SEM。*与对照组相比，P<0.05；每组4人。SSM：茎鞘下线粒体，IFM：纤维间线粒体。
图2
图2。小鼠和人样本中对照组和糖尿病线粒体亚群的线粒体蛋白表达分析
（A） 对对照组SSM（第1和第2通道）和糖尿病组SSM的（第3和第4通道）（B）、对照组IFM的（第一和第二通道）以及糖尿病组IFM（第三和第四通道）的丝裂原蛋白表达进行分析。SSM（C）和IFM（D）亚群中COX IV上丝裂原蛋白水平的条形图表示。SSM（E）和IFM（F）亚群中非糖尿病和1型糖尿病患者样本中丝裂原蛋白含量的分析。从人类患者样本中分离出的SSM（G）和IFM（H）中COX IV上丝裂原蛋白水平的条形图表示。数值表示为平均值±SE*对照组与糖尿病组相比P<0.05。COX IV（线粒体负荷对照）证实了对蛋白质负荷的控制；每组n=5。SSM：茎鞘下线粒体，IFM：纤维间线粒体。
图3
图3。ETC络合物的BN-PAGE分析
使用BNPAGE检测对照组、糖尿病组、丝裂原对照组和丝裂原糖尿病组线粒体亚群中ETC复合物的表达。（A） 两个对照样品包括以kDa为单位的分子量标记以及ETC复合物的大小。分别评估SSM（B-E）和IFM（F-I）亚群的ETC复合物I、III、IV和V的条形图表示。数值表示为平均值±SEM。每组n=6。SSM：肌膜下线粒体，IFM：纤维间线粒体，MW：分子量标记。
图4
图4。线粒体膜电位
从对照组、糖尿病组、丝裂原对照组和丝裂原糖尿病组心脏分离的线粒体与JC-1孵育，在（A）SSM和（B）IFM亚群中分析每个样本的100000个门控事件。数值表示为平均值±SEM*对对照组与糖尿病组和#对糖尿病患者与米托非林糖尿病患者的差异<0.05；n=每组8个。SSM：茎鞘下线粒体，IFM：纤维间线粒体。
图5
图5。脂质过氧化副产物
通过比色法测量脂质过氧化副产物丙二醛（MDA）和4-羟基烯醛（4-HAE），评估了对照组、糖尿病组、米托菲林对照组和米托菲林糖尿病组（A）SSM和（B）IFM亚群的脂质氧化损伤。将结果与已知4-HAE和MDA浓度的标准曲线进行比较。数值表示为平均值±SEM*对对照组与糖尿病组和#对糖尿病组与有丝分裂蛋白糖尿病组比较，<0.05；每组4人。SSM：茎鞘下线粒体，IFM：纤维间线粒体。
图6
图6。线粒体结构
（A）对照组、（B）糖尿病组、（C）米托非林对照组和（D）米托菲林糖尿病小鼠心脏左心室的电子显微照片（×16.0K）显示了1型糖尿病心脏IFM亚群中的线粒体形态和嵴结构。IFM：纤维间线粒体：肌原纤维。
图7
图7。线粒体内部复杂性
对对照组、糖尿病组、米托菲林对照组和米托菲林糖尿病组心脏的线粒体内部复杂性进行评估。如（A）SSM和（B）IFM的代表性直方图所示，使用正向散射和侧向散射来分析分离的线粒体。使用侧向散射与正向散射的比率来计算（C）SSM与（D）IFM线粒体的内部复杂性。数值表示为平均值±SEM*对对照组与糖尿病组和#对糖尿病组与有丝分裂蛋白糖尿病组比较，<0.05；n=每组8个。SSM：茎鞘下线粒体，IFM：纤维间线粒体。
图8
图8。线粒体动力学的Western Blot分析
分析对照组、米托菲林、米托菲林糖尿病组、糖尿病心脏（A）SSM和IFM线粒体中线粒体分裂、融合、Chchd3和Opa1蛋白的蛋白表达。通过COX IV（线粒体负荷控制）确认蛋白质负荷的控制；每组n=4。SSM：茎鞘下线粒体，IFM：纤维间线粒体。
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中的注释

  • 丝裂霉素：糖尿病心肌病的关键因素？
    Gorr MW，Wold LE公司。 Gorr MW等人。 分子细胞心血管杂志。2015年8月；85:292-3. doi:10.1016/j.yjmcc.2014.11.028。Epub 2014年12月9日。 分子细胞心血管杂志。2015 PMID：25500008 没有可用的摘要。

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