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案例报告
.2014年12月4日;95(6):708-20.
doi:10.1016/j.ajhg.2014.10.17。 Epub 2014年11月26日。

GTPBP3突变导致线粒体翻译缺陷,与肥厚性心肌病、乳酸性酸中毒和脑病相关

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案例报告

GTPBP3突变导致线粒体翻译缺陷,与肥厚性心肌病、乳酸性酸中毒和脑病相关

罗伯特·科帕提奇等。 美国人类遗传学杂志. .

摘要

呼吸链缺陷表现出多种临床表型,这些表型是由线粒体通过氧化磷酸化产生的能量缺陷引起的。这些缺陷可能由线粒体DNA突变或编码线粒体蛋白质的核基因突变引起。潜在的病理机制可以影响涉及线粒体生理学的许多途径。通过全外显子组和候选基因测序,我们从9个家族中鉴定了11个携带GTPBP3复合杂合或纯合突变的个体,GTPBP3编码线粒体GTP结合蛋白3。九个家庭中有八个家庭的患者出现骨骼肌复合呼吸链缺陷。GTPBP3的突变与严重的线粒体翻译缺陷有关,这与该蛋白催化五个线粒体tRNA反密码子摆动位置形成5-牛磺酸甲基尿苷(τm(5)U)的预测功能一致。所有病例受试者均表现为乳酸中毒,其中9人发展为肥厚型心肌病。与MTO1突变的个体相比,大多数GTPBP3突变的个体出现了类似于Leigh综合征的丘脑、壳核和脑干的神经症状和MRI受累。我们对线粒体翻译障碍的研究表明线粒体tRNAs转录后修饰对线粒体正常功能的重要性。

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图1
图1
GTPBP3号机组突变状态和基因结构(A)九个家族的突变谱系GTPBP3号机组(B)基因结构GTPBP3号机组已知基因产物的蛋白质结构域,并定位和保存受突变影响的氨基酸残基。黑色和橙色文本表示外显子和内含子变体。过渡区未按比例绘制。序列比对中的着色表示氨基酸残基的身份。
图2
图2
受影响个体#72425、#82790和#75168(A)的脑部MRI表现为双侧丘脑前部小T2高信号(箭头所示)。(B) 在#82790个体中,T2加权MRI显示壳核(箭头)和丘脑前部(箭头)的双侧高信号。(C) 个体#75168的T2加权MRI显示出明显的双侧高信号,影响到整个丘脑(箭头,左侧为轴向视图),并延伸至中脑(箭头右侧为矢状视图)。
图3
图3
成纤维细胞系呼吸缺陷和GTPBP3蛋白水平分析(A)在高糖(Glc)培养基中培养的5名受影响个体和5名对照受试者的成纤维细胞株的耗氧率(OCR)。每项分析都是在超过15个重复中进行的。对照组(C1)在不同的传代数下测量五次(C1.1–1.5,NHDFneo,Lonza)。OCR表示为相对于所有对照组平均值的百分比。#75191和#76671个体的细胞耗氧量显著降低,而#49665、#72425和#66143个体的细胞没有出现呼吸缺陷。错误栏显示1 SD;∗∗∗p<0.001。(B) 半乳糖(Gal)培养基中培养的成纤维细胞耗氧率。在含半乳糖培养基中培养的五个对照细胞的OCR比在含葡萄糖培养基中平均增加107%。来自个体#49665、#72425和#66143的细胞系显示OCR显著降低。wt的慢病毒表达GTPBP3号机组在来自个体#66143的细胞中,OCR的变化显著增加,尽管它对对照细胞(C6-T)的影响很小。错误条指示1 SD;∗∗∗p<0.001。(C) 根据制造商协议(LONZA),通过电穿孔转染空载体(pIRES2-EGFP)的单个#83904细胞中呼吸链复合物I和IV的活性(以与CII活性的比值表示)降低,但在表达GTPBP3号机组来自同一质粒的cDNA。如前所述进行测量。错误栏指示1 SD。控件中的活动设置为100%。∗∗p<0.01,∗∗p<0.001。(D) #49665、#75191和#66143个体的细胞中GTPBP3水平降低,用wt转导后升高GTPBP3号机组cDNA。MRPS18B和MRPL3作为线粒体负荷控制。
图4
图4
原代成纤维细胞和用针对GTPBP3的RNAi处理的HeLa细胞中线粒体蛋白合成的分析(A)[35S] 成纤维细胞线粒体蛋白的蛋氨酸代谢标记。线粒体翻译产物标记为[35S] 蛋氨酸30分钟,用4%–12%梯度SDS-PAGE分离,并通过放射自显影术观察。为了验证蛋白质负载量相等,用考马斯(CGS)对凝胶的一小部分进行染色。来自个体#49665、#66143和#75191的成纤维细胞显示出对线粒体蛋白合成的显著抑制,尽管来自个体#72425的细胞中的翻译不受影响。(B) 线粒体翻译放射性标记产物的量化。成立[35S] 如(A)所示,在三个独立实验中暴露于荧光成像仪屏幕后,通过ImageQuant软件进行量化。误差条显示1 SD。(C)通过RNA干扰下调HeLa细胞中的GTPBP3。转染两种不同siRNA到GTPBP3的HeLa细胞总裂解物的免疫印迹分析显示,RNAi处理6天后,GTPBP2水平降低。以GFP的siRNA作为转染对照。星号表示HeLa细胞中抗GTPBP3抗体识别的非特异性带。β-actin起到了负荷控制的作用。使用了两种不同的靶向GTPBP3的siRNA双链,1和2。(D) GTPBP3下调后HeLa细胞的线粒体翻译。用抗GTPBP3的siRNA转染HeLa细胞6天[35S] 蛋氨酸代谢标记。GTPBP3失活导致线粒体翻译效率降低。使用了两种不同的靶向GTPBP3的siRNA双链,1和2。
图5
图5
对10μg洗涤剂-固体化总细胞提取物的成纤维细胞中的OXPHOS蛋白进行免疫印迹分析,并对OXPHOS成分进行免疫印记分析。所有个体中SDHA(复合物II)和ATP5A(ATP酶)的数量没有变化。在#72425、#75191和#76671个体的细胞中,观察到COXIV(复合物IV)减少。来自个体#49665、#72425和#75191的细胞显示NDUFB8(复合物I)水平降低。使用的抗体:小鼠抗SDHA(ab14715)、NDUFB8(ab110242)、ATP5A(ab14748)的抗体,以及来自Abcam的兔抗COXIV(ab16056)和来自SIGMA Aldrich的兔抗GTPBP3(HPA042158)的兔抗体。

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