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.2015年1月2日；290(1):168-82.
doi:10.1074/jbc。M114.617167。 Epub 2014年11月21日。

MFN2对运动神经元谷氨酸兴奋性毒性和线粒体功能障碍的影响

王文章 1, 范张（音译） 2, 李丽 1, 方强汤 1, 桑德拉·西德拉克 1, 藤冈久志 三, 刘颖超 4, 苏波（Bo Su） 5, 严丕 6, 王兴隆 7
附属公司

MFN2对运动神经元谷氨酸兴奋性毒性和线粒体功能障碍的影响

王文章等。 生物化学杂志. .

摘要

线粒体功能障碍在谷氨酸诱发的神经元兴奋性毒性中起着重要作用，线粒体分裂/融合动力学对线粒体形态和功能至关重要。在这里，我们在脊髓运动神经元的谷氨酸兴奋性毒性、线粒体动力学和线粒体功能障碍之间建立了一种新的机制连接物。半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶对谷氨酸的Ca（2+）依赖性激活导致关键线粒体外膜融合调节因子丝裂原融合蛋白2（MFN2）降解，并导致MFN2介导的线粒体断裂导致谷氨酸诱导的神经元死亡。MFN2缺乏会损害线粒体功能，导致运动神经元死亡，并使运动神经元易受谷氨酸兴奋性毒性的影响。相反，MFN2过表达可阻断谷氨酸诱导的线粒体断裂、线粒体功能障碍和/或脊髓运动神经元在体外和小鼠中的神经元死亡。抑制钙蛋白酶激活也可以减轻谷氨酸诱导的线粒体和神经元兴奋性毒性。总的来说，这些结果表明，谷氨酸兴奋性毒性通过钙蛋白酶介导的运动神经元MFN2降解损害线粒体动力学，从而导致线粒体功能障碍，从而提出了谷氨酸兴奋毒性与线粒体功能障碍耦合的分子机制。

关键词：钙蛋白酶；兴奋毒性；谷氨酸；谷氨酸兴奋毒性；MFN2；线粒体；线粒体动力学；运动神经元；神经变性。

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图1。
图1。
谷氨酸诱导初级脊髓运动神经元线粒体断裂和DLP1和MFN2的减少。用25μ米谷氨酸和/或谷氨酸受体拮抗剂MK-801持续24小时。为了标记线粒体，在谷氨酸处理前2天用mitoDsRed2转染神经元。A、，用不同浓度的谷氨酸处理24小时的原代大鼠脊髓运动（DIV7）中LDH释放测定的细胞死亡。B、，25μl LDH释放法测定大鼠原代脊髓运动神经元（DIV7）的细胞死亡米不同时间点的谷氨酸。C、，用LDH释放法测定25μ米谷氨酸和/或谷氨酸受体拮抗剂MK-801 24小时典型共焦图像(D类)和量化(E类)mitoDsRed2阳性转染的原代大鼠脊髓运动神经元（DIV8）的线粒体长度。插入比例尺，5微米。每组分析50多个神经元。代表性免疫印迹(F类)和量化分析(G公司)线粒体融合蛋白MFN2（相对于肌动蛋白）的表达。加载等量的蛋白质（10μg）并通过肌动蛋白确认。H、，用谷氨酸处理24小时后，从神经元分离的线粒体（DIV7）中代表性免疫印迹和DLP1表达的定量。加载等量的蛋白质（20μg），并用VDAC1进行确认。细胞质标记物GAPDH和内质网标记物calnexin证实了制备的线粒体部分的纯度。所有实验都重复了四次以上。数据为平均值±S.E.统计：采用单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey多重比较检验。A类和B类, *,对与未经治疗的对照神经元相比，<0.05。对于其他面板，*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001;纳秒，无显著性。
图2。
图2。
MFN2缺乏会损害初级脊髓运动神经元的线粒体动力学和功能。为了产生MFN2缺乏神经元，小鼠初级运动神经元(Mfn2公司飞行/飞行神经元）分离自Mfn2公司仅用Cre、GFP-Cre或mitoDsRed2-Cre转染漂浮小鼠，或感染编码mitoDs Red2和Cre的慢病毒。神经元也被转染/联合转染GFP标记的miR RNAi结构以9:1的比率敲除DLP1（Cre结构/GFP-RNAi结构，9:1的比例使>99%的GFP阳性神经元也呈Cre阳性）。A、，代表性免疫印迹和定量分析证实了Cre表达降低Tg运动神经元中MFN2的表达。典型共焦图像(B类)和量化(C类)mitoDsRed2阳性转染的原代小鼠脊髓运动神经元（DIV8）中的线粒体长度，如图所示。红色，丝裂原-DsRed2。每组分析50多个神经元。细胞内活性氧水平的测量(D类)、基质金属蛋白酶(E类)，OCR公司(F类和G公司)，ATP(H（H）)和LDH测定的神经元死亡(我)如图所示。J、，转染3天后，通过碘化丙啶检测阳性转染神经元的神经元死亡数量。每组分析200多个神经元。所有实验重复三次。数据为平均值±S.E.统计：单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001.催化裂化装置，羰基氰化物对-三氟甲氧基苯腙；纳秒，无显著性。
图3。
图3。
MFN2而非DLP1过度表达(石油当量)防止谷氨酸诱导的初级脊髓运动神经元线粒体断裂。为了过度表达MFN2，用Myc-tagged MFN2和mitoDsRed2联合转染原代大鼠脊髓运动神经元（DIV5），或只转染MitoDsRed 2，并用25μ米谷氨酸在DIV7作用24小时。典型共焦图像(A类)和量化(B类)阳性转染有丝分裂DsRed2的原代大鼠脊髓运动神经元过度表达MFN2（DIV8）的线粒体长度。在DIV5处用丝裂原DsRed2和Myc-tagged DLP1转染原代大鼠运动神经元，并用25μ米谷氨酸在DIV7作用24小时。神经元用针对Myc和DLP1的特异性抗体进行双重染色。典型共焦图像(C类)和量化(D类)阳性转染的原代脊髓运动神经元过度表达DLP1（DIV8）的线粒体长度。红色，丝裂原-DsRed2；绿色，Myc；白色，DLP1。每组分析50多个神经元。所有实验都重复了四次以上。数据为平均值±S.E.统计：单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001;纳秒，无显著性。
图4。
图4。
MFN2对谷氨酸诱导的初级脊髓运动神经元线粒体功能障碍和神经元死亡的保护作用。从过度表达人MFN2的转基因小鼠的Tg神经元和NTg神经元中分离出的原代小鼠脊髓运动神经元（DIV7）分别用25μ米谷氨酸24小时。A、，有代表性的免疫印迹和定量分析证实了MFN2（相对于肌动蛋白）在Tg运动神经元中的过度表达。加载等量的蛋白质（10μg），并通过肌动蛋白进行确认。用丝裂原DsRed2标记法测量线粒体长度(B类)和细胞内活性氧水平(C类)、基质金属蛋白酶(D类)，光学字符识别(E类和F类)，三磷酸腺苷(G公司)和LDH测定的神经元死亡(H（H）). 所有实验重复三次。数据为平均值±S.E.统计：单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对< 0.001;纳秒，无显著性。
图5。
图5。
谷氨酸兴奋性毒性期间线粒体形态和MFN2表达的时间进程研究。 A、，25μ米谷氨酸。B、，25μ米谷氨酸。至少分析了50个细胞。C、，25μg后不同时间点运动神经元MFN2表达的代表性免疫印迹及定量分析米谷氨酸处理。加载等量的蛋白质（10μg）并通过肌动蛋白确认。数据为平均值±S.E.统计：单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。所有实验重复三次。*，对与转染空载体的未经处理的大鼠运动神经元相比，<0.05(矢量控制).
图6。
图6。
MFN2对小鼠线粒体和运动神经元谷氨酸兴奋性毒性的保护作用体内.谷氨酸以10 m的浓度溶解在aCSF中米通过微型泵（1μl/h流速）将其输送至4-6月龄NTg小鼠和过度表达MFN2（Tg）的转基因小鼠的侧脑室。连续输注7天后处死小鼠。A、，对照小鼠（未经手术或仅注射aCSF）脊髓匀浆中MFN2（相对于肌动蛋白）的代表性免疫印迹和定量(n个=5或6只小鼠/组）或输注谷氨酸的年龄匹配的小鼠(n个=3只小鼠/组）。加载等量的蛋白质（20μg）并通过肌动蛋白确认。VDAC1被用作线粒体特异性标记物。B、，腰椎MFN2的代表性免疫细胞化学。星号表示运动神经元中具有代表性的MFN2染色。C、，TOM20的免疫染色(绿色)在腰椎脊髓中。细胞核用DAPI染色，神经元形状用MAP2染色。左侧两个面板显示运动神经元线粒体的大视野右侧面板显示了线粒体代表性三维图像的放大区域（来自细胞体和Neurite嵌件记为白线框).彩色地图底部使用彩色编码光谱提供线粒体长度信息。D、，基于三维图像的线粒体长度（最大椭球轴长度）量化。n个=3或4只小鼠/组。每只小鼠有20多个神经元成像。E、，有/无谷氨酸输注的NTg和Tg小鼠脊髓运动神经元线粒体的典型EM显微照片。下部面板是线粒体典型超微结构形态的放大区域。F、，裂解caspase3的代表性免疫染色(绿色)-腰椎脊髓中的阳性运动神经元。细胞核用DAPI染色。箭头指向变形核。G、，星形细胞标志物胶质纤维酸性蛋白的代表性免疫染色(GFAP公司)以及腰椎脊髓中的小胶质标记物Iba1。黑色箭头指向运动神经元；红色箭头指向星形胶质细胞；和蓝色箭头指向小胶质细胞。n个=3–6只小鼠/组。数据为平均值±S.E.统计：单因素方差分析后进行Tukey多重比较检验。*，对< 0.05; **,对< 0.01, ***,对< 0.001;纳秒，无显著性。
图7。
图7。
钙蛋白酶对初级脊髓运动神经元谷氨酸激发的MFN2降解。 A、，运动神经元（DIV7）用25μ米实时PCR检测线粒体动态蛋白mRNA水平。大鼠脊髓运动神经元MFN2（相对于肌动蛋白）表达的代表性免疫印迹和定量分析(第7部分)处理或不处理25μ米谷氨酸盐和/或2.5μ米细胞内钙螯合剂BAPTA-AM(B类和C类), 20 μ米钙蛋白酶抑制剂钙肽(D类和E类)、和20μ米泛酶抑制剂Z-VAD-FMK(F类和G公司)24小时或5米米大分子自噬抑制剂100n米自噬抑制剂巴非霉素A1(博鳌亚洲论坛), 5 μ米蛋白酶体抑制剂乳酸菌素(LACT公司)和3-甲基腺嘌呤(3毫安) (H（H）和我)持续8 h。加载等量的蛋白质（10μg）并通过肌动蛋白确认。VDAC1被用作线粒体特异性标记物。典型共焦图像(J)和量化(K（K）)经或不经25μ米谷氨酸和/或钙蛋白酶抑制剂钙肽24小时。为了标记线粒体，在治疗前2天用mitoDsRed2转染神经元。红色，丝裂原-DsRed2。每组分析50多个神经元。L、，通过LDH分析测量细胞内ROS、MMP、ATP水平和神经元死亡。所有实验重复三次。数据为平均值±S.E.统计：单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。*，对< 0.05;纳秒，无显著性。
图8。
图8。
钙蛋白酶对MFN2的降解作用在体外. A、，重组人MFN2在不同单位μ-钙蛋白酶存在下在30°C下30分钟的代表性免疫印迹。钙蛋白酶抑制剂钙肽可完全抑制MFN2重组体的裂解。箭头表示MFN2，以及星号表示二聚/聚合MFN2。B、，重组人MFN2在0.5单位μ-钙蛋白酶存在下30°C不同时间点的代表性免疫印迹。C、，在30°C下与μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶孵育30分钟后，从小鼠皮层分离的纯化线粒体中的MFN2、MFN1、OPA1和COXIV的代表性免疫印迹。D、，在30°C下与μ-钙蛋白酶和/或钙肽蛋白/PMSF孵育30分钟后，从小鼠皮层分离的纯化线粒体中的MFN2的代表性免疫印迹。所有实验至少重复三次。E、，谷氨酸处理24小时后神经元中MFN2片段的代表性图片。箭头表示MFN2。所有实验都重复了三次以上。
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