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.2015年1月；14(1):177-90.
doi:10.1074/mcp。M114.040360。 Epub 2014年11月7日。

细胞溶质羧肽酶1天然底物的C末端组学筛选揭示了酸性蛋白C末端的加工

塞巴斯蒂安·坦科 1, 奥利维娅·托特 2, 汉斯·德莫尔 三, 弗朗西斯科·泽维尔·阿维莱斯 2, 克里斯·格瓦尔特 三, 佩特拉·范·达姆 4, 朱莉娅·洛伦佐 5
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细胞溶质羧肽酶1天然底物的C末端组学筛选揭示了酸性蛋白C末端的加工

塞巴斯蒂安·坦科等。 分子细胞蛋白质组学. 2015年1月.

摘要

细胞质羧肽酶（CCPs）是与轴突再生和神经元变性等相关的M14金属羧肽酶类的一个新亚科。CCPs是去谷氨酸化酶，能够催化聚谷氨酸侧链和微管蛋白、telokin和肌球蛋白轻链激酶基因编码的C末端的缩短。这些酶的功能尚不完全清楚，部分原因是缺乏有关细胞中C末端蛋白质加工及其功能含义的信息。通过C末端COFRADIC（一种定位蛋白质组学方法），我们寻找CCP1的细胞底物靶点，CCP1是该家族中最相关的成员。我们在此鉴定了七种新的推测CCP1蛋白底物，包括核糖体蛋白、翻译因子和高迁移率组蛋白。此外，我们首次证明CCP1同时处理谷氨酸盐和C末端天冬氨酸盐。这些C末端在分子相互作用中的意义进一步表明，CCP1介导的酸性蛋白尾部缩短可能调节蛋白-蛋白质和蛋白-DNA相互作用。

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数字

图1。
图1。
CCP1过度表达增加了Δ2-微管蛋白的水平。 A类，CCP1转染HEK293T细胞。从对照细胞或表达HA标记CCP1的细胞中制备蛋白质提取物。使用抗HA抗体通过Western blot分析样品（30μg蛋白质提取物）。除了主要的150-kDa谱带外，还可以观察到～120–130 kDa和80–90 kDa的其他谱带，类似于文献中先前报道的模式（2，37）。B类，微管蛋白PTMs的检测。使用抗Δ2-微管蛋白和抗Tyr-微管蛋白抗体通过Western blot分析对照细胞或CCP1表达细胞的提取物。Western blot检测抗β-肌动蛋白作为负荷控制。
图2。
图2。
通过C-末端COFRADIC分析鉴定CCP1转染细胞中的C-末端蛋白水解过程。 A类，表示未经CCP1处理的蛋白质。剪刀表示胰蛋白酶裂解位点。N端胰蛋白酶肽用红色表示。C端胰蛋白酶多肽用绿色/蓝色表示。内部胰蛋白酶肽呈黄色。B类，表示由CCP1处理的C末端蛋白质。C类，未在两个蛋白质组中处理的C末端肽（肽a）的质谱表示。该质谱同样代表了一种C-末端肽，该肽显示了不同于CCP1的蛋白酶在两种蛋白质组中的基本降解。D类，CCP1（肽B）处理的蛋白质的完整C末端肽的质谱表示。E类，CCP1（肽C）处理的蛋白质的新C末端肽的质谱表示。F类，α-微管蛋白1A/1B作为CCP1底物的鉴定。α-微管蛋白1A/1B的三重带电新C末端的质谱13C类4-EDMAALEKDYEEVGVDSVEGEEG（残基423-448；但是13C类4，α-氨基改性13C类4-丁酸）。
图3。
图3。
TRAD1和HMGB3是直接CCP1基质。 A类，CCP1能够去除TRAD1的所有酸性C端氨基酸。显示了PolyE抗体识别的表位。B类，TRAD1的C终端由活动CCP1处理。斯特雷普/HA标记的TRAD1在HEK293F细胞中与活性CCP1或非活性（E270Q）CCP1共转染。TRAD1从蛋白质提取物中富集，使用斯特雷普-塔克汀柱。用免疫印迹法分析等量的蛋白洗脱液-斯特雷普抗体。CCP1也通过其C端富集斯特雷普-标签。当与非活性CCP1共表达时，polyE抗体显示TRAD1 C末端的完整性，而与活性酶共表达时则不显示。C类,体外TRAD1作为直接CCP1底物的验证。在存在或不存在MCP抑制剂邻菲罗啉（o-Phen）的情况下，纯化的重组TRAD1与CCP1在37°C下孵育2 h，并使用polyE抗体进行Western blot分析。D类HMGB3由两个中心DNA结合域（HMG-box）和一个长的酸性C末端尾部组成。CCP1能够从其C末端依次释放多达16种酸性氨基酸。HMG盒和酸性尾的大小只是说明性的，并不代表它们的实际大小。E类，HMGB3由CCP1处理。斯特雷普-标记HMGB3与活性或非活性（E270Q）CCP1共转染。使用HA-tag抗体通过Western blot分析等量的每个细胞提取物，以证明两种CCP1变体的表达水平相等。使用抗体的蛋白质印迹-斯特雷普当与活性CCP1共表达时，抗体显示HMGB3的降解形式。F类,体外HMGB3作为直接CCP1基质的验证。纯化的重组HMGB3与CCP1 ON在37°C下孵育，存在或不存在10m米邻苯并用SDS-PAGE分析。
图4。
图4。
HMGB2和HMGB1由CCP1处理。CCP1能够切割A类HMGB1和B类，HMGB2。N-末端Myc-tagged HMGB1或HMGB2与活性或非活性CCP1共转染。使用HA-tag抗体通过Western blot分析等量的每个细胞提取物，以显示两种CCP1变体的同等表达水平。使用抗Myc抗体进行的Western blotting显示，当与活性CCP1共同表达时，HMGB蛋白质的C末端处理形式出现。
图5。
图5。
根据假定CCP1底物得出的底物特异性曲线。与参考集相比，IceLogo（35）用于显示不同CCP1假定底物位置处的富集残留物(即Swiss-Prot数据库中人类蛋白质的C末端）。对于iceLogo的制备，我们考虑到MCP会依次释放氨基酸。因此，当释放一些氨基酸以得到最终鉴定的产物时，消化的中间产物充当新的底物，并被CCP1进一步消化。因此，在制备iceLogo时，消化的中间产物被视为不同的单独底物，因此，考虑了35种CCP1底物。这里只考虑那些通过蛋白质组学鉴定的底物。在表示中，底物残留物根据Schechter&Berger命名法进行描述。将序列集中每个位置的氨基酸出现频率与参考集中的出现频率进行比较。只有具有统计意义的残留物第页绘制值≤0.05。氨基酸高度表示实验组与参考组中位置氨基酸频率的差异程度。在实验数据集中，残留物在统计上表现过高或过低，分别显示在iceLogo的上部或下部。
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