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.2014年10月23日；16(10):801-13.
doi:10.1016/j.neo.2014.08.007。 eCollection 2014年10月。

FLI1表达与乳腺癌细胞生长、迁移、侵袭和基因表达改变相关

梅丽莎·谢贝尔 1, 帕特里夏·M·沃森 2, 蒂哈娜·伦博尔德 三, 康纳·斯坦利 4, 罗伯特·威尔逊 5, 维多利亚·J·芬德利 6, 保罗·安德森 4, 丹尼斯·K·沃森 1
附属公司

FLI1表达与乳腺癌细胞生长、迁移、侵袭和基因表达改变相关

梅丽莎·谢贝尔等。 肿瘤形成. .

摘要

ETS因子在乳腺癌中被证明是失调的。ETS因子控制参与许多生物过程的基因表达，如细胞增殖、分化和凋亡。FLI1是一种ETS蛋白，在逆转录病毒诱导的血液肿瘤中异常表达，但对FLI1在上皮源性肿瘤中的作用的研究较少。通过数据挖掘，我们发现FLI1表达缺失与乳腺癌生存期缩短和侵袭性表型增加有关。功能获得和丧失的细胞研究表明FLI1表达对细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用。使用Fli1突变小鼠和转基因小鼠乳腺癌模型以及原位注射同基因肿瘤细胞表明，减少Fli1有助于加快肿瘤生长。FLI1和另一ETS基因PDEF过度表达的侵袭性人类乳腺癌细胞系的全球表达分析和RNA-Seq数据显示，与癌症相关的几个细胞途径发生了变化，例如细胞因子-细胞因子受体相互作用和PI3K-Akt信号通路。本研究证明FLI1在上皮细胞中的新作用。此外，这些结果表明FLI1在乳腺癌中的下调可能促进肿瘤的进展。

关键词：Ad-FLI1、Ad-GFP-FLI1；上皮间质转化；雌激素受体；FLI1，Friend白血病病毒整合1；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GEO，基因表达总览；GOBO，乳腺癌在线基因表达结果；浸润性导管癌；免疫组织化学；浸润性小叶癌；N、 正常乳腺组织；前列腺衍生ETS因子；PyVT，FVB/N-Tg（MMTV-PyVT）634Mul/J；视网膜母细胞瘤；T、 肿瘤；uPA，尿激酶纤溶酶原激活剂。

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数字

图1
图1
FLI1在人类乳腺癌和乳腺细胞系中的表达减少。（A） GEO数据库：从60例ER+侵袭性乳腺肿瘤样本中获得FLI1 mRNA水平。GEO加入GDS807（参考文献30）。（B） Oncomine数据库：左侧，FLI1 mRNA水平来自7个正常乳腺样本，与40个浸润性导管癌（IDC）进行比较（参考文献31）。右，与35例IDC和16例浸润性小叶癌（ILC）相比，3例正常乳腺样本的FLI1 mRNA水平（参考文献32）。（C） GOBO数据库：1881例乳腺肿瘤中FLI1表达三分位数的总生存率和无复发生存率。1 +; 偶发核2+（IHC分数：115，IHC T/N:33%）（放大倍数=400×；比例尺=50μm）。（D） （E）不同亚型乳腺癌中FLI1的相对表达。（F） 来自标准化为GAPDH的人类乳腺癌细胞系的FLI1 mRNA的RT-PCR（代表两个独立实验，一式三份）。（G） 人类乳腺细胞系FLI1蛋白表达水平的Western blot分析。
图2
图2
FLI1再表达抑制人类浸润性乳腺癌细胞的生长。（A） 亲代（未感染）细胞或感染Ad-GFP或Ad-FLI1的细胞的细胞活力测定，P（P）通过双向方差分析得出<0.05。（B） 与亲代（未感染）细胞相比，感染Ad-GFP或Ad-FLI1后72小时的死亡细胞百分比。（C） 通过流式细胞仪对腺病毒感染后36小时（左）和72小时（右）的亲代细胞或感染Ad-GFP或Ad-FLI1的细胞进行细胞周期分析*P（P）<.05（学生）t吨测试。
图3
图3
FLI1表达抑制细胞迁移和侵袭。（A和B）定量细胞在纤维连接蛋白涂层（A）或基质涂层（B）转运孔中的迁移。这些列表示迁移/侵入细胞的平均值占亲代（未感染）细胞的百分比。（C） 使用抗FLI1抗体对稳定感染shFLI1#1或shFLI1#2的MCF-10A细胞进行Western blot分析。（D和E）定量细胞在纤维连接蛋白涂层（D）或基质涂层（E）转运孔中的迁移。这些列表示迁移的细胞的平均值占亲代（未感染）细胞的百分比*P（P）<.05（学生）t吨测试。
图4
图4
Fli1表达水平影响肿瘤生长和转移。（A） PyVT野生型和PyVT-Fli1+/-小鼠的无瘤生存率（对数秩检验P（P）= .043). （B） PyVT野生型和PyVT-Fli1+/-小鼠的肿瘤生长。两个斜率之间差异的显著性。（p=0.015）（C）PyVT野生型和PyVT-Fli1+/-小鼠的总体存活率（log-rank试验P（P）=.048）（D）Ki67在PyVT野生型和Fli1+/-小鼠肿瘤中的染色(P（P）<.0001由t吨测试）。Ki67染色的代表性肿瘤切片（比例尺=250μm）。（E） PyVT野生型和Fli1+/-小鼠肿瘤中激活的caspase-3染色(P（P）<.02）。用活化的Caspase-3抗体染色的代表性肿瘤切片（比例尺=250μm）。（F） PyVT野生型和Fli1+/-小鼠的肺转移面积(P（P）= .03). H&E染色肺叶的代表性切片（12.5×）。（G） 正常小鼠乳腺（i）和野生型PyVT肿瘤（ii）和Fli1+/-（iii）（40×）的Fli1染色显示肿瘤细胞中Fli1缺失。
图5
图5
Fli1基因型对原位注射EO771细胞生长的影响。（A） 野生型C57BL6和Fli1ΔCTA小鼠的肿瘤生长。虚线表示肿瘤的实际生长，实线表示肿瘤生长的线性回归（斜率差异的显著性P（P）<.03）（B）EO771注射野生型C57BL6和Fli1ΔCTA小鼠的肺转移数量(P（P）< .02). （C） 野生型C57BL6和Fli1+/-小鼠的EO771肿瘤生长。（坡度差异的显著性P（P）<.02）（D）EO771注射野生型和Fli1+/−小鼠的总体存活率（log-rankP（P）< .05).
图6
图6
FLI1和PDEF调节控制侵袭和转移的基因表达。（A） 使用抗FLAG M5抗体对父母和Ad-GFP、Ad-FLI1或Ad-PDEF感染的MDA-MB-231细胞进行Western blot分析。（B） 将乳腺癌细胞系中p21 mRNA的表达水平归一化为S26：对照（未感染）细胞，或感染Ad-GFP或Ad-PDEF或Ad-FLI1的细胞。（C） 乳腺癌细胞系S26正常化后SLUG和（D）uPA mRNA表达水平的qRT-PCR：对照（未感染）细胞，或感染Ad-GFP、Ad-PDEF或Ad-FLI1的细胞。每个图表是两个独立实验的平均值，一式三份。*第05页。
图7
图7
FLI1和PDEF调节许多与癌症相关的基因的表达。（A） 该图是通过使用编程语言R和ggplot2库计算每组FPKM值的频率密度而创建的。为了便于查看，引入了FPKM（x轴）的上限。（B和C）PDEF/GFP的折叠变化值与FLI1/GFP的折叠变化数值的绘图。图上的各个点代表基因，根据两种表型中的折叠变化是否大于2将基因细分为组(■) 单一表型(▼PDEF；◊FLI1），或两者都不是表型(○). 绘图是使用编程语言R使用ggplot2库创建的。FLI1/GFP的倍数变化与PDEF/GFP的倍数变化。（B）中显示的阳性折叠变化对应于治疗（FLI1和PDEF）相对于GFP的表达增加。（C）中显示的负折叠变化对应于与GFP相比，治疗的表达减少。（D） 维恩图显示了AdPDEF和AdFLI1处理细胞中过表达或表达不足的基因数量。斜体数字是正向改变的基因，下划线是负向改变的基因。每个圆圈中的数字都是每个细胞系独有的数字。中间是AdPDEF和AdFLI1在同一方向上改变的基因数量，或那些在相反方向上改变（灰色数）的基因数量。（E） qPCR验证所选基因的折叠变化水平。红色条：AdPDEF转染MDA-MB231。蓝色条：AdFLI1转染MDA-MB231。
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