跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年1月；29(1):14-27.
doi:10.1210/me.2014-1077。

雌激素介导的线粒体基因表达调控

玛丽亚·洛佩斯·桑切斯 1, Anne-Marie J Shearwood公司, Tiongsun Chia公司, 斯特凡·M·K·戴维斯, 奥利弗·瑞克汉姆, 阿列克桑德拉·菲利波夫斯卡
附属公司

雌激素介导的线粒体基因表达调控

玛丽亚·洛佩斯·桑切斯等。 分子内分泌学. 2015年1月.

摘要

雌激素，尤其是17β-雌二醇，是众所周知的重要细胞功能调节因子；然而，它们作用于线粒体的机制仍存在差异。在此，我们提出了一种新的机制，用于在代谢应激下雌激素直接调节线粒体基因表达。我们发现，在缺乏血清的培养基中，雌激素刺激雌激素受体-α快速重新定位到线粒体，在线粒体中引发细胞反应，导致线粒体RNA丰度增加。线粒体RNA水平通过雌激素受体-α与17β-羟基类固醇脱氢酶10的结合来调节，17β-羟类固醇脱水酶10是一种参与类固醇代谢的多功能蛋白质，也是线粒体核糖核酸酶P复合物的核心亚基，负责线粒体多顺反子转录物的裂解。线粒体转录物的处理通过控制可用于翻译的成熟RNA的水平影响线粒体基因的表达。这项工作提供了线粒体基因表达中RNA处理和雌激素激活之间的第一种机制，并强调了细胞核和线粒体对应激的协调反应。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1.通过免疫印迹法检测MCF-7细胞A、ERα中HSD17B10和ERα的表达，这些细胞来自于生长在无血清基础培养基和无血清培养基中的MCF-7和细胞，然后与100 nM E2孵育18小时。
使用孔蛋白作为对照，以确认标准化蛋白质负荷。Bars表示血清耗尽细胞中相对线粒体ERα水平或HSD17B10的平均±SD，归一化为孔蛋白，并与在有或无E2的基础、未耗尽培养基中生长的细胞进行比较。使用双尾Student’s检验统计显著性t吨测试*，P（P）<0.05（n=3）。ERα和HSD17B10细胞分布通过免疫印迹法从基础培养基（B）或去血清培养基（C）中培养的MCF-7细胞的细胞裂解物和线粒体部分进行评估，然后与100 nM E2孵育18小时。
图2。
图2.HSD17B10与ERα相互作用。
A、 用IgG琼脂糖珠从在无血清培养基中生长的MCF-7细胞中分离出内源性ERα，表达HSD17B10-TAP（48 kDa），在存在或不存在100 nM E2的情况下表达18小时，然后进行TEV蛋白酶裂解。B、 TAP分析显示内源性HSD17B10（27kDa）从表达ERα-TAP的细胞中分离出来。免疫印迹上可以看到IgG重链（50kDa）和轻链（23kDa。C和D，EGFP作为对照，以显示TAP程序的特异性。
图3。
图3 HSD17B10和ERα在MCF-7细胞线粒体中共存。
A、 ERα主要为细胞核，但在E2处理后迅速募集到MCF-7细胞的线粒体中。在无血清培养基中生长的细胞转染表达ERα的质粒，该质粒在C端融合到EGFP，然后与100 nM E2孵育5分钟、3小时或18小时。然后用MitoTracker Orange（MT Orange）培养细胞，染色活细胞中的线粒体并固定。ERα-EGFP（绿色）可见于细胞核中，也可见于线粒体中，覆盖图像中MT橙色（红色）染色的线粒体中（黄色）。比例尺为10μm。B、 HSD17B10存在于MCF-7细胞的细胞质和线粒体内的斑点中。用表达HSD17B10的质粒转染在去血清培养基中生长的细胞，该质粒在C端融合到EGFP，然后与100 nM E2孵育5分钟、3小时或18小时。然后将细胞与MitoTracker Orange（MT Orange）一起孵育以染色活细胞中的线粒体并固定。HSD17B10-EGFP（绿色）可见于细胞质中，覆盖图像（黄色）中MT橙色（红色）染色的线粒体中。比例尺为10μm。
图4。
图4线粒体RNA处理蛋白的敲除。
A、 通过qRT-PCR测定MCF-7细胞线粒体RNA处理蛋白相对于对照细胞的mRNA敲除水平，并将其归一化为18S rRNA。条形代表平均值±标准偏差t吨对配对数据进行了测试，结果表明，与对照组相比，mRNA显著减少(P（P）< .05; n=3）。B、 将转染对照NT、TRMT10C、HSD17B10、PRORP、PTCD1或ELAC2 siRNAs的MCF-7细胞分离的线粒体在无血清培养基中免疫印迹72小时，然后再次转染72小时以提高敲除效率，并在有或无100 nM E2的情况下免疫印迹18小时。抗体用于检测siRNA介导的敲除后TRMT10C、HSD17B10、PRORP、PTCD1或ELAC2的表达水平。用孔蛋白作为对照，以确认蛋白质载量相等。印迹是四个独立生物实验的代表。C、 免疫印迹实验的密度分析表明，在E2存在和不存在的情况下，与对照细胞相比，siRNA处理显著降低了蛋白质丰度。该图显示了每个siRNA靶蛋白的相对水平，归一化为孔蛋白，并与NT对照进行了比较。条形代表相对平均值±标准偏差。对配对数据进行了Student双尾t检验，结果表明蛋白质水平相对于对照组显著降低(P（P）< .05).
图5。
图5：RNA处理蛋白对线粒体RNA水平的E2依赖性影响。
A、 在100nM E2存在或不存在下，从用对照NT、TRMT10C、HSD17B10、PRORP、PTCD1或ELAC2-siRNA转染的MCF-7细胞中分离RNA 18小时，以通过Northern印迹测定线粒体转录物的稳态水平。核18S rRNA丰度被用作总RNA负荷的内部控制。所示数据是三种独立RNA制剂重复的典型结果。每个印迹都通过剥离和重制来探测不同的RNA物种。B，Northern印迹显示RNA加工蛋白敲除对tRNA稳态水平的影响伊利有无100 nM E2。
图6。
图6.E2对线粒体RNA加工的依赖性影响。
从转染对照NT、TRMT10C、HSD17B10、PRORP（A）PTCD1或ELAC2（B）siRNA的MCF-7细胞中分离出RNA，在存在或不存在100 nM E2的情况下持续18小时，通过qRT-PCR相对于对照NT siRNA处理的细胞来确定线粒体RNA处理的影响，并将其归一化为18S rRNA。所示数据是三种独立RNA制剂重复的典型结果。数据是三个单独实验的平均值±SD。P（P）<0.05标有星号。
图7。
图7 PTCD1与ERα相关。
A、 用IgG琼脂糖珠从在无血清培养基中生长的MCF-7细胞中分离出内源性ERα（67 kDa），在100 nM E2存在或不存在的情况下表达PTCD1-TAP（98 kDa。B、 利用PTCD1特异性单克隆抗体进行反向TAP分析，检测从表达ERα-TAP（88 kDa）的细胞中分离出的内源性PTCD1（77 kDa。
图8。
图8线粒体转录物处理受损导致蛋白质表达降低。
通过掺入35线粒体翻译机器合成的13种蛋白质中的S-标记蛋氨酸和半胱氨酸。MCF-7细胞在去血清培养基中生长，转染靶向TRMT10C、HSD17B10、PRORP或NT对照（A）的siRNA，以及靶向PTCD1、ELAC2或NT对照的siRNA（B），然后用100 nM E2处理18小时。依米汀抑制了细胞质蛋白质的合成。补充图4A中显示了考马斯素染色凝胶，其显示细胞裂解物的等负荷。C、 在雌激素存在的情况下，TRMT10C的敲低会降低mtDNA编码的蛋白质合成。图表显示了与孔蛋白标准化的相对蛋白质水平。条形代表相对平均值±SD。使用双尾Student’s检验统计显著性t吨测试，并用星号表示。*，P（P）<0.05（n=3）。D、 敲除ELAC2可降低mtDNA编码的蛋白质合成。图表显示了与孔蛋白标准化的相对蛋白质水平。条形代表相对平均值±SD。使用双尾Student’s检验统计显著性t吨测试，并用星号表示。*，P（P）<0.05（n=3）。对在无血清培养基中培养的MCF-7细胞分离的线粒体蛋白进行免疫印迹分析，并转染靶向TRMT10C、HSD17B10、PRORP或NT对照（E）的siRNA和靶向PTCD1、ELAC2或NT对照的siRNA，然后用100 nM E2治疗18小时。抗体用于检测线粒体DNA编码的细胞色素的表达水平c（c）氧化酶亚基COX1和COX2以及nDNA编码复合物II SDHA亚基。使用孔蛋白作为对照，以确认标准化蛋白质负荷。G、 在含或不含100 nM E2的无血清培养基中培养18小时，测量MCF-7细胞的线粒体耗氧量。数据是三个单独实验的平均值±SD(P（P）<.05，n=3）。H、 用qRT-PCR法测定用HSD17B10或NT对照siRNAs处理的MCF-7细胞在100 nM E2存在或不存在的情况下TFAM、PGC-1和PPARγ的mRNA水平。与缺乏E2相比，添加E2后表达的折叠变化如图所示。数据归一化为18S rRNA，条形代表平均值±SDt吨对配对数据进行了测试，结果显示mRNAs相对于对照组发生了显著变化(P（P）<.05，n=3）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. 霍尔JM，库塞JF，科拉赫KS。雌二醇和雌激素受体信号的多方面机制。生物化学杂志。2001年；276(40):36869–36872.-公共医学
    1. Vascosuelo A、Pronsato L、Ronda AC、Boland R、Milanesi L。17β-雌二醇和睾酮在细胞凋亡中的作用。类固醇。2011;76(12):1223–1231.-公共医学
    1. Revankar CM、Cimino DF、Sklar LA、Arterburn JB、Prossnitz ER。跨膜细胞内雌激素受体介导快速细胞信号传导。科学。2005;307(5715):1625–1630.-公共医学
    1. Losel R，Wehling M.类固醇激素的非基因组作用。Nat Rev Mol细胞生物学。2003;4（1）：46–56。-公共医学
    1. 莱文ER。质膜雌激素受体。内分泌代谢趋势。2009;20(10):477–482.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

赠款和资金

这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会（拨款APP1058442、APP1045677、APP1041582、APP1023460和APP1005030）和澳大利亚研究委员会（赠款FT0991008、FT0991113和DP140104111）的研究金和项目拨款（给A.F和O.R.）的支持。