Caspase-9 mediates Puma activation in UCN-01-induced apoptosis

doi:10.1038/cddis.2014.461

.2014年10月30日；5（10）：e1495。

doi:10.1038/cddis.2014.461。

Caspase-9在UCN-01诱导的细胞凋亡中介导Puma活化

C聂¹, Y Luo（Y罗）¹, X赵¹, N罗², A大钳¹, X刘¹, Z元¹, C王¹, Y Wei先生¹

附属公司

¹中华人民共和国成都市人民南路17号四川大学华西医院和生命科学学院生物治疗与癌症中心国家重点实验室/生物治疗协同创新中心，邮编610041。
²南开大学医学院/生物治疗协同创新中心，天津300071，中华人民共和国。

PMID： 25356864
预防性维修识别码：项目经理4649536
内政部： 10.1038/cddis.2014.461

Caspase-9在UCN-01诱导的细胞凋亡中介导Puma活化

C聂等。细胞死亡疾病. 2014.

.2014年10月30日；5（10）：e1495。

doi:10.1038/cddis.2014.461。

作者

C聂¹, Y Luo（Y罗）¹, X赵¹, N罗², A大钳¹, X刘¹, Z元¹, C王¹, Y Wei先生¹

附属公司

¹中华人民共和国成都市人民南路17号四川大学华西医院生命科学学院生物治疗与癌症中心国家重点实验室/生物治疗协同创新中心610041。
²南开大学医学院/生物治疗协同创新中心，天津300071，中华人民共和国。

PMID： 25356864
预防性维修识别码：项目经理4649536
内政部： 10.1038/cddis.2014.461

摘要

蛋白激酶抑制剂7-羟基staurosporine（UCN-01）是最有效和最常用的促凋亡刺激物之一。据报道，Bcl-2家族蛋白的BH3-唯一分子有助于UCN-01诱导的细胞凋亡。在这里，我们发现UCN-01触发彪马诱导的线粒体凋亡途径。我们的数据证实了Akt-FoxO3a途径介导Puma激活。重要的是，我们阐明了Puma诱导细胞凋亡的详细机制。我们的数据还表明，caspase-9是UCN-01治疗后Puma诱导的决定性分子。Caspase-9通过两种反馈回路介导细胞凋亡。一方面，caspase-9通过不依赖于caspase-3裂解Bcl-2和Bcl-xL来增强Puma的活化。另一方面，在caspase-3存在的情况下，caspase-9直接激活caspase-3。Caspase-3可以在另一个正反馈回路中切割XIAP，以进一步使癌细胞对UCN-01诱导的细胞凋亡敏感。因此，caspase-9介导Puma活化，以确定克服癌细胞化疗耐药性的阈值。

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数字

图1
UCN-01在癌细胞中诱导Puma。用指定浓度的UCN-01处理细胞24小时 h、然后收集并裂解以检测Puma的表达。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。显示了三个实验的代表性结果，结果一致

图2
UCN-01治疗后，Akt-FoxO3a途径直接介导Puma诱导。(一)用Si-Ctrl或Si-FoxO3a-1转染细胞48 h、然后用UCN-01（1 μHCT116 p53 KO和250的M A2780/CP为nM），24 h.通过western blot检测处理细胞的蛋白质水平。(b条)用Si-Ctrl或Si-FoxO3a-1转染细胞48 h、然后用UCN-01（2 μHCT116 p53 KO和250的M nM用于A2780/CP），用于48 h.如材料和方法部分所述，使用细胞死亡ELISA试剂盒定量检测细胞凋亡。图表显示了定量分析的结果(n个=3，平均值±S。D.、***P（P）*<0.01). (**c（c）**)FoxO3a与Puma启动子关联的量化。ChIP是用抗FoxO3a多克隆抗体与蛋白G包被磁珠在4 °C隔夜旋转。与靶蛋白FoxO3a共免疫沉淀的DNA片段进行QRT-PCR。对未经处理（con）或用UCN-01（1）处理的细胞进行QRT-PCR分析 μHCT116 p53 KO和250的M 对于A2780/CP为nM）24 h.y轴上的数字表示FoxO3a与Puma启动子区关联的水平，在归一化为输入样本的Ct值后。所示数据为平均值±S。来自三个独立的实验。(d日)在12个固定癌细胞上进行ChIP UCN-01（1）的h μHCT116 p53 KO和250的M 用于A2780/CP的nM）处理。使用FoxO3a特异性抗体或无抗体来显示特异性。PCR是使用围绕Puma启动子中FoxO3a结合位点的引物进行的。(**e（电子）**)用Ctrl和组成活性Akt1（T308D和S473D）载体转染癌细胞48 h，然后用UCN-01（1）处理 μHCT116 p53 KO和250的M A2780/CP为nM），24 h.对处理后的细胞进行裂解检测。对于FoxO3a核转位分析，用UCN-01培养细胞，并按照材料和方法一节所述进行亚细胞分离。核FoxO3a被称为N-FoxO3a，细胞溶质FoxO3a被称为C-FoxO3。拉明B1被用作核标记物。数据代表至少三个独立实验

图3
Puma是UCN-01的化学增敏作用所必需的，并介导细胞凋亡。(一)用指定浓度的UCN-01处理细胞48 h.收集细胞并进行裂解以检测凋亡。如材料和方法部分所述，使用细胞死亡ELISA试剂盒定量检测细胞凋亡。图表显示定量分析的结果(n个=3，平均值±S。D.、***P（P）*<0.01). (b条)用2 μM UCN-01用于48 h、然后采集进行PI染色。通过流式细胞术分别评估亚-G1细胞和凋亡细胞。给出了三个实验的代表性结果，结果一致。(**c（c）**)用2 μM UCN-01持续48小时。收集细胞并进行裂解以进行western blot分析。CF是指半胱天冬酶-3的裂解片段。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(d日)HCT116或HCT116 Puma KO细胞用2 μM UCN-01 48号 h.按照材料和方法一节中的描述，使用细胞死亡ELISA试剂盒对细胞进行裂解以检测细胞凋亡。图表显示定量分析的结果(n个=3，平均值±S。D.、***P（P）*<0.01)

图4
Puma是UCN-01诱导MEF细胞凋亡所必需的。(一)MEF细胞用6 μM UCN-01用于48 h、然后固定细胞并进行Cyt免疫染色*c（c）*如“材料和方法”部分所述。细胞核用DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）复染。箭头表示Cyt释放*c（c）*箭头表示核凝聚和分数。(b条)MEF细胞用6 μM UCN-01用于48 h、然后进行蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(**c（c）**)用Si-Ctrl或Si-Puma-1,2转染MEF细胞48 h、然后用6 μM UCN-01用于48 h.收集处理后的细胞进行western blot分析。给出了三个实验的代表性结果，结果一致。(d日)如中所述(**c（c）**)收集处理后的细胞进行细胞凋亡检测。图表显示定量分析的结果(n个=3，平均值±S。D.中***P（P）*<0.01)

图5
Caspase-9调节Puma诱导的细胞凋亡。(一)HCT116 p53 KO、Puma KO、MCF-7和MCF-7 Si Puma-1细胞用2 μM UCN-01用于48 h.收集处理后的细胞并进行裂解，以进行western blot分析。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(b条)用zLEHD（20 μM）（一种特定的caspase-9抑制剂） h、然后用2 μM UCN-01用于48 h.收集处理过的细胞并裂解以进行蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(**c（c）**)如中所述(b条)Annexin V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡

图6
Caspase-9降解Bcl-2和Bcl-xL以增强Puma诱导的凋亡。(一)HCT116 p53 KO细胞用2 μM UCN-01在不同的时间点。收集处理后的细胞并进行裂解，以检测Bcl-2和Bcl-xL降解。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(b条)用zLEHD（20 μM）（一种特定的caspase-9抑制剂） h、然后用2 μM UCN-01用于48 h.收集处理后的细胞并进行裂解，以检测Bcl-2和Bcl-xL降解。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(**c（c）**)用HA-Bcl-2载体稳定转染HCT116 p53 KO细胞，然后用2 μM UCN-01用于48 h.用抗HA抗体裂解细胞以检测Bcl-2降解。(d日). 如中所述(**c（c）**)，细胞转染HA-Bcl-xL。用抗HA抗体裂解细胞以检测Bcl-xL降解。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(**e（电子）**)按中所述处理细胞(**c（c）**)Annexin V/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。(如果)如中所述(d日)用HA-Bcl-xL载体稳定转染细胞，Annexin阳性染色检测细胞凋亡

图7
(一)用zDEVD（20 μM）（一种特异性胱天蛋白酶3抑制剂） h、然后用250 nM UCN-01、100 nM UCN-01和15 μM CP（适用于A2780/CP）或2 μM UCN-01500 nM UCN-01和15 μM CP（用于HCT116 p53 KO）用于48 h.收集处理后的细胞并进行裂解，以进行western blot分析。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(b条)如中所述(一)，用细胞死亡ELISA试剂盒检测细胞凋亡，如材料和方法部分所述。图表显示定量分析的结果(n个=3，平均值±S。D.、***P（P）*<0.01). (**c（c）**)用Ctrl或全caspase-3载体转染MCF-7细胞48 h、然后用2 μM UCN-01用于48 h.（左）收集胎面细胞并进行裂解以进行western blot分析。（右）如材料和方法部分所述，使用细胞死亡ELISA试剂盒对细胞进行裂解以检测凋亡。图表显示定量分析的结果(n个=3，平均值±S。D.、***P（P）*<0.01). (d日)用si-Ctrl或si-Casp-3-1转染HCT116 p53 KO和A2780/CP细胞48小时 h、然后用UCN-01处理48 h.对处理后的细胞进行western blot分析。(**e（电子）**)用zDEVD（20 μM）和/或MG132（蛋白酶体抑制剂）（20 μM）对于1 h、然后使用或不使用UCN-01、CP或其组合治疗48 h用于western blot分析。(如果)用WT XIAP Flag或XIAP（D242E）-Flag载体转染细胞48 h、然后用zDEVD和/或MG132（20 μM）对于1 h.使用或不使用UCN-01、CP或其组合处理细胞48 h用于western blot分析。所有数据均代表三个独立实验

图8
Smac有助于XIAP耗竭、caspase处理和细胞凋亡增强。(一)HCT116 p53 KO细胞用UCN-01、CP或其联合治疗48例 h，如图7所示，并进行亚细胞分离。对细胞溶质或线粒体部分进行免疫印迹。β-肌动蛋白被用作蛋白质负载Ctrl。(b条)用Si-Ctrl或Si-Puma-1转染细胞48 h.收集一部分处理过的细胞用于蛋白质印迹分析，并对另一部分处理过的细胞进行亚细胞分级。细胞溶质部分进行免疫印迹。(**c（c）**)用Ctrl、WT-Smac-Flag或Smac-ΔMTS-Flag转染细胞48 h、然后用2 μM UCN-01用于48 h.收集一部分处理细胞进行western blot分析。用抗Flag抗体检测转染的Smac，并对另一部分处理细胞进行亚细胞分离。细胞溶质部分进行免疫印迹。(d日)用Si-Ctrl或Si-Smac-1，2转染细胞48 h、然后用2 μM UCN-01用于48 h.按照材料和方法一节中的描述，使用细胞死亡ELISA试剂盒对细胞进行裂解以检测细胞凋亡。图表显示定量分析的结果(n个=3，平均值±S。D.、***P（P）*<0.01)

图9
UCN-01抑制肿瘤生长体内. (一)将细胞系皮下注射到6-8周龄裸鼠BALB/c雌性裸鼠的右背侧翼。肿瘤生长7天后，将荷瘤小鼠随机分为以下两组（每个治疗组10只）：(一)Ctrl组和(b条)UCN-01治疗组。如材料和方法部分所述，向小鼠腹膜内注射UCN-01。在指定日期测量肿瘤大小并计算体积(**P（P）*<0.05). (b条)将细胞系注射到裸鼠体内，并按照(一). 在指定日期测量肿瘤大小并计算体积(**P（P）*<0.05). (**c（c）**)停止实验后，测量动物的肿瘤重量变化。在A2780/CP肿瘤模型中，UCN-01治疗的小鼠肿瘤重量存在显著差异与显示Ctrl键(**P（P）*<0.05). (d日)如中所述(**c（c）**)显示HCT116 p53 KO模型的肿瘤重量(**P（P）*<0.05). 在其他肿瘤模型的肿瘤重量中，UCN-01治疗没有显著差异与Ctrl键(*P（P）*>0.05). (**e（电子）**)每隔3天绘制A2780/CP小鼠模型的体重。不同组之间的体重没有显著差异(*P（P）*>0.05). 数值显示为平均值±S。D(如果)如中所述(**e（电子）**)显示HCT116 p53 KO小鼠模型的体重。不同组之间的体重没有显著差异(*P（P）*>0.05). 数值显示为平均值±S。D。

**图10**
肿瘤模型中的TUNEL分析。对切除的肿瘤进行称重，并将其固定在PBS中4%的多聚甲醛中，嵌入石蜡中并切割成3-5个 μm段。这些截面用于TUNEL实验。TUNEL染色的肿瘤组织制备和程序在材料和方法一节中介绍。(一和b条)使用TUNEL分析检测不同HCT116 p53 KO或A2780/CP肿瘤模型中的凋亡细胞。显示了具有代表性的部分。(**c（c）**和d日)显示不同肿瘤模型的凋亡指数。图表显示了定量分析的凋亡结果。在不同的HCT116 p53 KO或A2780/CP肿瘤模型中，UCN-01治疗的肿瘤的凋亡指数存在显著差异与显示Ctrl键(***P（P）*<0.01). 在其他肿瘤模型中，UCN-01治疗的凋亡指数无显著差异与Ctrl键(*P（P）*>0.05)

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[10] 5Yu J，Wang Z，Kinzler KW，Vogelstein B，Zhang L.PUMA介导大肠癌细胞对p53的凋亡反应。美国国家科学院院刊2003；100: 1931–1936.-项目管理咨询公司-公共医学

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