CLUH regulates mitochondrial biogenesis by binding mRNAs of nuclear-encoded mitochondrial proteins

doi:10.1083/jcb.201403129

.2014年10月27日；207(2):213-23.

doi:10.1083/jcb.201403129。

CLUH通过结合核编码线粒体蛋白的mRNA调节线粒体生物发生

附属公司

¹科隆大学遗传学研究所、分子医学中心、科隆基因组学中心和科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群，科隆，50923，德国科隆遗传研究所，分子医学中心，科隆基因组中心，和科隆老年相关疾病细胞应激反应卓越集群，科隆大学，50923科隆，德国。
²科隆大学分子医学中心遗传学研究所、科隆基因组学中心和科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群，德国科隆50923。
^三德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系，邮编77030 Jan；德克萨斯州休斯敦儿童医院丹·邓肯神经研究所，邮编770.30。
⁴科隆大学遗传学研究所、分子医学中心、科隆基因组学中心和科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群，科隆，50923，德国科隆遗传研究所，分子医学中心，科隆基因组中心，和科隆大学关于衰老相关疾病中细胞应激反应的科隆卓越集群，50923科隆，德国遗传学研究所，分子医学中心，科隆基因组学中心，以及科隆大学的关于衰老相关病中细胞应激响应的科隆优秀集群，5092科隆，德国Elena.Rugarli@uni-koeln.de。

PMID： 25349259
预防性维修识别码：项目经理4210445
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CLUH通过结合核编码线粒体蛋白的mRNA调节线粒体生物发生

杰高等。 J细胞生物学. 2014.

.2014年10月27日；207(2):213-23.

doi:10.1083/jcb.201403129。

附属公司

¹科隆大学遗传学研究所、分子医学中心、科隆基因组学中心和科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群，50923科隆，德国遗传学研究所、分子医学中心、科隆基因组学中心，和科隆老年相关疾病细胞应激反应卓越集群，科隆大学，50923科隆，德国。
²德国科隆大学遗传学研究所、分子医学中心、科隆基因组中心和科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群，科隆50923。
^三德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系，邮编77030 Jan；德克萨斯州休斯敦儿童医院丹·邓肯神经研究所，邮编770.30。
⁴科隆大学遗传学研究所、分子医学中心、科隆基因组学中心和科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群，科隆，50923，德国科隆遗传研究所，分子医学中心，科隆基因组中心，和科隆大学关于衰老相关疾病中细胞应激反应的科隆卓越集群，50923科隆，德国遗传学研究所，分子医学中心，科隆基因组学中心，以及科隆大学的关于衰老相关病中细胞应激响应的科隆优秀集群，5092科隆，德国Elena.Rugarli@uni-koeln.de。

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摘要

线粒体功能需要两个基因组的协调才能实现蛋白质的生物发生、有效的质量控制机制以及细胞内细胞器的适当分布。目前尚不清楚这些机制是如何整合的。Clu1/CluA同源基因（CLUH）的缺失导致线粒体网络通过未知机制聚集。我们发现CLUH与编码线粒体蛋白的基因以及与核糖体生物发生和翻译相关的基因共同调控。我们的功能分析确定CLUH是一种细胞溶质信使核糖核酸（RNA；mRNA）结合蛋白。RNA免疫沉淀实验和下一代测序表明，CLUH特异性结合编码线粒体蛋白的mRNA子集。CLUH耗竭降低了靶转录物翻译的蛋白质水平，并导致线粒体聚集。一部分CLUH与酪氨酸化微管蛋白共定位，可在线粒体附近检测到，表明其在调节靶转录物在线粒体附近的转运或翻译中起作用。我们的数据揭示了线粒体生物发生和分布之间的一种新机制。

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数字

**图1。**
联合监管分析*CLUH公司。*（A）共存基因网络的基因本体分析*CLUH公司*/克鲁生物过程基因本体术语的折叠富集如图所示（P<10⁻⁴). 绿色虚线对应于1的倍数富集。（B）细胞景观生成克鲁基因调控网络。编码线粒体和核糖体生物发生相关蛋白的基因被突出显示，并由蓝线连接，蓝线的颜色强度与其共同调控的程度成比例。（C和D）GSEA克鲁线粒体基因（C）和核糖体生物发生基因（D）的调控网络。x轴显示了共调控列表中前20000个基因的排名。顶部的图表显示了强化分数。中间的面板显示了富集图，其中基因的相对位置用垂直的蓝色条表示（左边，最类似于克鲁[红色]；右，表达方式与克鲁[蓝色]）。底部的图表显示了排名列表中基因集的累积分布。50%的线粒体和核糖体生物发生基因集出现在最初的～15和7%克鲁共同监管清单。

**图2。**
**CLUH的亚细胞定位。**（A和B）内源性CLUH信号可以被COS7细胞中的RNAi有效地耗尽。白线表示单元格的边界。（C–F）CLUH与酪氨酸化微管蛋白（tyr-tub）部分共定位。（G–N）Triton X-100提取可溶性蛋白后，CLUH亚细胞模式发生变化（将G与K进行比较，将J与N进行比较），并且CLUH修饰用抗抑制素抗体标记的线粒体（PHB1；N）。F、 J和N显示放大的方框区域。（O）小鼠大脑和肝脏的亚细胞分离。星号表示来自SDHA的剩余信号。黑线表示中间车道已拼接。POR，细胞色素P450还原酶。（P）通过蔗糖梯度沉淀肝轻膜，以获得富含核糖体和RAP的颗粒。将该颗粒重新悬浮在高盐缓冲液中，并进一步离心，以从核糖体（颗粒）中释放RAP（上清液）。（Q） HeLa细胞中的多聚体剖面。组分的紫外线吸收率显示在顶部，相应的蛋白质印迹显示在底部。棒材：（A、C–E、G–I和K–M）20µM；（F、J和N）2.5µm。

**图3。**
**CLUH缺失导致线粒体聚集。**（A） COS7细胞被沉默*咯咯的*-特异或对照siRNA。线粒体用MitoTracker红染色。白线表示细胞边界。（B） COS7细胞线粒体聚集表型的量化。每次实验计数300–400个细胞(n个= 3). （C）代表性COS7细胞的电子显微照片。右侧图像显示了方框区域的更高放大率。（D） MEF线粒体质量的FACS分析。x轴显示了峰值荧光强度的对数刻度。FITC-A，FITC区域模式。显示了三个代表性实验中的一个。（E）野生型和克鲁-用mito-mCherry转染缺陷MEF。（F和G）用ImageJ量化线粒体图谱。每次实验至少分析50个细胞(n个= 3). ***, P≤0.001。棒材：（A和E）20µm。误差条显示平均值的标准误差。WT，野生型。

**图4。**
**CLUH是一种RBP，与编码线粒体蛋白的mRNA结合。**（A）使用所示抗体对HeLa细胞进行CLIP实验的自射线照片。紫外线交联后可以看到预期大小的RNA-蛋白质复合物（箭头），当应用较低浓度的RNase时，会转移到较高摩尔重量的涂片（括号）。H、高核糖核酸酶浓度；五十、核糖核酸酶浓度低。底部显示相应的蛋白质印迹。（B）表达空载体或CLUH-FLAG结构的HEK 293T细胞CLIP实验的自体放射自显影图。紫外线交联后可以看到预期大小的RNA-蛋白质复合物，并通过降低RNase的浓度将其转移到更高的摩尔重量。底部显示相应的蛋白质印迹。（C）与IgG RIP相比，CLUH-RIP中的转录物富集了五倍以上（P<0.01）。样本通过灵巧路径分析进行分析。横线表示最重要的通路、功能和疾病注释的p值。（D）通过定量RT-PCR测量的CLOH免疫沉淀的转录物相对于IgG抗体的倍数富集(n个= 3–5). 误差条显示平均值的标准误差。

**图5。**
**CLUH缺失会降低靶mRNA编码的蛋白质水平。**（A）克鲁KO不影响MEF中的一般翻译率。CHX，环己酰亚胺。（B）聚酯切片克鲁与野生型（WT）细胞相比，KO MEF没有显示出明显的差异。这个实验已经完成了一次。（C） WT和KO MEF的Western blot用针对CLUH靶转录物和对照转录物编码蛋白的抗体修饰。（D） CLUH靶基因和对照基因转录本的定量RT-PCR克鲁KO MEF公司。每个转录物的水平表示为与GAPDH的比率(n个= 4). （E） C中显示的Western blot定量(n个= 4). （F） E中的蛋白质水平归一化为D.***中的RNA水平，P≤0.001；**，P≤0.01；*，P≤0.05。误差条显示平均值的标准误差。

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1. Anders，S.和Huber W.，2010年。序列计数数据的差异表达分析。基因组生物学。11:R106。10.1186/gb-2010-11-10-r106-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Cashman，N.R.、Durham H.D.、Blusztajn J.K.、Oda K.、Tabira T.、Shaw I.T.、Dahrouge S.和Antel J.P.，1992年。神经母细胞瘤x脊髓（NSC）杂交细胞系类似于发育中的运动神经元。开发动态。194:209–221. 10.1002/aja.1001940306-内政部-公共医学
1. Castello，A.、Fischer B.、Eichelbaum K.、Horos R.、Beckmann B.M.、Strein C.、Davey N.E.、Humphreys D.T.、Preiss T.、Steinmetz L.M.等人。2012年，从哺乳动物mRNA-结合蛋白图谱中了解RNA生物学。单元格。149:1393–1406. 2016年10月10日/j.cell.2012.04.031-内政部-公共医学

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