跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2014年11月28日；289(48):33568-89.
doi:10.1074/jbc。M114.599480。 Epub 2014年10月9日。

抗癌药二-2-吡啶酮4,4-二甲基-3-氨基硫脲（Dp44mT）通过两种机制克服了前体自噬：持续诱导自噬体合成和破坏溶酶体完整性

伊莱恩·古铁雷斯 1, 德斯·理查森 2, 帕特里克·詹森 三
附属公司

抗癌药二-2-吡啶酮4,4-二甲基-3-氨基硫脲（Dp44mT）通过两种机制克服了前体自噬：持续诱导自噬体合成和破坏溶酶体完整性

伊莱恩·古铁雷斯等。 生物化学杂志. .

摘要

自噬在细胞应激期间起着生存机制的作用，并有助于抵抗抗癌药物。选择性抗肿瘤和抗转移螯合剂二-2-吡啶酮4,4-二甲基-3-氨基硫脲（Dp44mT）会导致溶酶体膜渗透和细胞死亡。考虑到溶酶体在自噬和细胞死亡中的整体作用，评估Dp44mT对自噬的影响以进一步了解其作用机制是很重要的。值得注意的是，Dp44mT通过两种机制影响自噬。首先，在具有抗增殖活性的同时，由于诱导自噬体合成，Dp44mT增加了经典自噬标记物LC3-II的表达。其次，自噬底物和受体p62的积累显示了自噬体降解的减少，从而补充了这种作用。相反，经典的铁螯合剂去铁胺只能通过抑制自噬体降解来诱导自噬小体的积累。氧化还原活性铁或铜Dp44mT复合物的形成对于其对自噬的双重作用至关重要。细胞保护抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸抑制Dp44mT诱导的自噬体合成和p62积累。重要的是，Dp44mT通过溶酶体破坏抑制自噬体降解。这种作用阻止了溶酶体与自噬体融合形成自溶体，这对自噬过程的完成至关重要。Beclin1和ATG5沉默抑制了Dp44mT的抗增殖活性，表明持续自噬体合成在Dp44m T诱导的细胞死亡中的作用。这些研究表明，Dp44mT可以通过利用自噬过程来增强细胞死亡，从而克服癌细胞自噬的生存活性。

关键词：自噬；癌症治疗；细胞死亡；Dp44mT；铁螯合剂；溶酶体；药理学。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
TAM、Dp44mT和DFO增加自噬经典标记LC3-II的表达，与它们在MCF7细胞中的抗增殖活性相关。 A类和B类，用TAM（10μ米)，Dp44mT（0.01、0.1和5μ米)，或DFO（5、50和250μ米)24小时后(A类)或48小时培养(B类).C类，Western blotting用于研究LC3-I/II表达在24或48小时用相同试剂培养细胞后的变化A类和B、D类，密度分析结果（任意单位）C.E公司用TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)，DFO（250μ米)，Baf A1（100 n米)，氯喹（10μ米)或Dp2mT（5μ米).比例尺，10微米。中的结果A类和B类是三个实验的平均值误差线代表S.D.Blots，如C类是三个实验中的典型。密度分析D类是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与控件。免疫荧光照片E类有三个实验的代表性。
图2。
图2。
Dp44mT而非DFO诱导自噬启动。 A类，图表描述了LC3-II总水平的变化，这可能是由于自噬体合成增加和/或降解减少所致。我当自噬发生在基础状态时，形成的自噬体与溶酶体融合后降解，LC3-II水平保持不变。ii（ii），存在Baf A1（100 n米)，自噬体降解和自噬-溶酶体融合受到抑制。这会导致LC3-II的积累，这反映了自噬体对特定因子的反应程度。三当Baf A1阻断自噬体降解并引入自噬诱导剂时，自噬小体合成相对于基础状态增加，导致LC3-II积累增加。B类，用对照培养基或含有Baf A1（100 n）的培养基预培养MCF7细胞米)在37°C下培养30分钟，然后用对照培养基或Baf A1培养基（100 n）培养24或48小时37°C米)TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米). Western blotting检测LC3-I/II的表达。C类，密度分析结果（任意单位）B、D类，MCF7细胞与对照培养基或含有Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续0-8小时。Western blotting检测LC3-I/II的表达。E类，密度分析结果（任意单位）D.F公司，用对照培养基或含有Baf A1（100 n）的培养基预培养MCF7细胞米)在37°C下培养30分钟，然后用Dp44mT（5μ米)单独，Baf A1（100 n米)单独或两者结合。Western blotting检测LC3-I/II的表达。G公司，密度分析结果（任意单位）F类。所示斑点代表三个实验。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与控件。#，第页<0.05；##，第页< 0.01与仅Baf A1。
图3。
图3。
Dp44mT增加生命周期324或48小时孵育后的mRNA水平。 A类，MCF7细胞与TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续24或48小时。进行半定量RT-PCR以研究生命周期3mRNA水平。B类，密度分析结果（任意单位）A类所示凝胶代表了三个实验。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.***，第页< 0.001与控件。
图4。
图4。
Dp44mT和DFO抑制自噬体降解。 A类，示意图显示了如何使用p62监测自噬流量。我，p62通过直接结合LC3-II选择性地并入自噬体，并通过自噬降解。ii（ii）当诱导自噬通量时，会形成更多的自噬体，导致p62的降解增加。三当自噬体降解受到抑制而导致自噬通量受损时，可以观察到p62的积累。B类，MCF7细胞与TAM（10μ米)，Dp44mT（0.01、0.1和5μ米)，或DFO（5、50和250μ米)在37°C下持续24或48小时。Western blotting检测p62和LC3-II表达的变化。C类，p62 Western blots的密度分析（任意单位）B类。所示斑点代表三个实验。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与控件。
图5。
图5。
Dp44mT上调第62页mRNA水平。 A类，MCF7细胞与TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续24或48小时。进行半定量RT-PCR以研究第62页mRNA水平。B类，密度分析结果（任意单位）交流MCF7细胞与对照培养基或含有Act D（4μ米)在37°C下培养2小时，然后用对照培养基或含有TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)有无D法案（4μ米). 进行半定量RT-PCR以研究第62页mRNA水平。D类，密度分析结果（任意单位）C类所示凝胶代表了三个实验。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.***，第页< 0.001与控件。
图6。
图6。
Dp44mT在MDA-MB-231和T47D乳腺癌细胞系中诱导自噬启动并抑制自噬体降解。 A类，MDA-MB-231细胞与对照培养基或含有Baf A1（100 n米)在37°C下培养30分钟，然后用对照培养基或含有TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在存在或不存在Baf A1（100n米). 进行蛋白质印迹以研究LC3-I/II的表达。B类，中的结果的密度计分析（任意单位）交流T47D细胞在与A类Western blotting检测LC3-I/II的表达。D类，密度分析结果（任意单位）C.E公司、MDA-MB-231或T47D细胞与TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续24小时。Western blotting检测p62表达的变化。F类，结果的密度分析（任意单位）E类。所示斑点代表三个实验。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01与控件。#，第页< 0.01与仅Baf A1。
图7。
图7。
Dp44mT结合铁或铜，诱导LC3-II水平升高。 A类，MCF7细胞与对照培养基或含有Dp2mT（5μ米)，Dp44mT（5μ米)，铁[Dp44mT]2(5 μ米)，DFO（250μ米)，Fe[DFO]（250μ米)，或氯化铁三(5 μ米)在37°C下单独放置24或48小时。Western blotting检测LC3-I/II和p62的表达。B类，密度分析结果（任意单位）交流将MCF7细胞与对照培养基或含有Dp44mT（0.1和5μ米)，铜[Dp44mT]（0.1和5μ米)，或CuCl2（5μ米)在37°C下放置24小时。进行蛋白质印迹以研究LC3-I/II和p62的表达。D类，密度分析结果（任意单位）C类。所示斑点代表三个实验。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与对照组或治疗组之间如图所示。
图8。
图8。
Dp44mT的氧化还原活性诱导自噬启动并减少自噬体降解。 A类，用对照培养基或含有NAC（10 m）的培养基预培养MCF7细胞米)单独，Baf A1（100 n米)单独或NAC（10 m米)+Baf A1（100 n米)在37°C下培养30分钟，然后用对照培养基或含有Dp44mT（5μ米)，Baf A1（100 n米)，Dp44mT（5μ米)+Baf A1（100 n米)，NAC（10米米)仅NAC（10 m米)+Baf A1（100 n米)，Dp44mT（5μ米)+NAC（10米米)或Dp44mT（5μ米)+NAC（10米米)+Baf A1（100 n米). Western blotting检测LC3-I/II的表达。B类，密度分析结果（任意单位）交流，MCF7细胞与对照培养基或含有NAC（10 m米)在37°C下培养30分钟，然后用对照培养基或含有Dp44mT（5μ米)仅NAC（10 m米)单独或Dp44mT（5μ米)+NAC（10米米). Western blotting检测p62的表达。D类，密度分析结果（任意单位）C类。所示斑点代表三个实验。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与对照或在所指示的处理之间，第页< 0.001与仅Baf A1。
图9。
图9。
Dp44mT通过引起溶酶体不稳定降低自噬体降解。 A类，MCF7细胞与对照培养基或含有TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续24小时。面板i吖啶橙染色显示溶酶体完整性（20n米)使用荧光显微镜。在相同条件下，显示亮场照片以说明细胞形态。比例尺，10微米。第二组流式细胞术检测红、绿荧光。B类，MCF7细胞与对照培养基或含有NAC（10 m米)在37°C下培养30分钟，然后用对照培养基或含有Dp44mT（0.1μ米)，Dp44mT（5μ米)，DFO（250μ米)单独或NAC（10 m米)单独或与这些药物联合使用。面板i吖啶橙染色显示溶酶体完整性（20n米)使用荧光显微镜。比例尺，10微米。第二组流式细胞术检测红、绿荧光。所示图像是三个实验的典型-绿：红荧光比率的倍增是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与对照组或治疗组之间如图所示。
图10。
图10。
Dp44mT破坏Cat D和LAMP-2的共定位，表明溶酶体受损，并降低自噬体标记LC3-II和LAMP-2.的共定位。MCF7细胞与对照培养基或含有TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)，或DFO（250μ米)在37°C下放置24小时。A类和B类，检测Cat D与LAMP-2共同定位的免疫荧光研究(A类)以及LC3与LAMP-2的共同定位(B类). 散点图和Mander重叠系数(第页)使用ImageJ进行计算。所示的典型图像是三个实验的典型图像。比例尺，10微米。
图11。
图11。
沉默Beclin1(贝克1)或ATG5(自动液位计5)减少Dp44mT诱导的自噬增加。 A类，转染阴性对照siRNA的MCF7细胞或贝克1siRNA与对照培养基或含有TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续24或48小时。Western blotting检测Beclin1和LC3-I/II的表达。B类，密度分析结果（任意单位）交流，转染阴性对照siRNA的MCF7细胞或自动液位计5siRNA在与A类Western blotting检测ATG5和LC3-I/II的表达。D类，密度分析结果（任意单位）C类。所示每项研究中具有代表性的Western blot是三个实验的典型。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与对照组或治疗组之间如图所示。
图12。
图12。
静音Beclin1(贝克1)或ATG5(ATG5型)抑制Dp44mT诱导的细胞死亡。 A类、转染阴性对照siRNA的MCF7细胞的细胞活力或贝克1用对照培养基或含有TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续24或48小时。B类、转染阴性对照siRNA的MCF7细胞的细胞活力或自动液位计5在与A类。中的结果A类和B类是三个实验的平均值误差线代表S.D.**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001与对照组或治疗组之间如图所示。
图13。
图13。
通过沉默Beclin1或ATG5抑制自噬启动抑制Dp44mT诱导的细胞凋亡。 A类，转染阴性对照siRNA的MCF7细胞或贝克1siRNA与对照培养基或含有TAM（10μ米)，Dp44mT（5μ米)或DFO（250μ米)在37°C下持续24或48小时。通过annexin V-FITC染色检测细胞凋亡的发生，并用流式细胞术定量。B类，转染阴性对照siRNA的MCF7细胞或自动液位计5在与A类通过annexin V-FITC染色检测细胞凋亡的发生，并用流式细胞术定量。C类，转染阴性对照siRNA的MCF7细胞或贝克1在与A类Western blotting检测Bax和Bcl-2表达的变化。D类，Bax和Bcl-2的密度分析（任意单位）C类显示为Bax:Bcl-2比率。E类，转染阴性对照siRNA的MCF7细胞或自动液位计5在与B类Western blotting检测Bax和Bcl-2表达的变化。F类，中Bax和Bcl-2的密度测定分析（任意单位）E类显示为Bax:Bcl-2比率。膜联蛋白V染色的分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.每个研究的代表性Western blot是三个实验的典型。密度分析是三个实验的平均值误差线代表S.D.*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与对照组或治疗组之间如图所示。
图14。
图14。
演示Dp44mT通过1）同时诱导自噬以增加自噬体合成和2）通过破坏溶酶体完整性防止自噬降解为自溶体，在将自噬转化为细胞死亡过程中的作用的示意图。后者已被证明是由于Dp44mT能够形成氧化还原活性铜络合物，氧化还原循环生成ROS，从而诱导LMP（27）。溶酶体完整性的丧失导致其内容物释放到胞浆中，从而诱导细胞凋亡（27）。这两种机制导致的自噬体积累导致受损蛋白质和细胞器的积累，除了LMP诱导的细胞凋亡外，还会引起细胞死亡。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Kondo Y.，Kanzawa T.，Sawaya R.，Kondo S.（2005）自噬在癌症发展和治疗反应中的作用。Nat.Rev.癌症5，726–734-公共医学
    1. Kroemer G.，JäätteläM.（2005）细胞死亡控制中的溶酶体和自噬。Nat.Rev.Cancer癌症杂志5886–897-公共医学
    1. Lum J.J.、DeBerardinis R.J.和Thompson C.B.（2005）后生动物的自噬：富饶之地的细胞生存。自然修订版分子细胞生物学。6, 439–448-公共医学
    1. Mathew R.，Karantza-Wadsworth V.，White E.（2007），自噬在癌症中的作用。Nat.Rev.Cancer癌症杂志7，961–967-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kurz T.、Terman A.、Gustafsson B.、Brunk U.（2008）《铁代谢、衰老和凋亡中的溶酶体》。组织化学。细胞生物学。129, 389–406-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语