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.2014年12月1日；307（11）:E1009-19。
doi:10.1152/ajpendo.00364.2014。 Epub 2014年10月7日。

早期甲基供体缺乏改变雌性幼鼠小脑中cAMP信号通路和神经类固醇生成

莎拉·埃尔·哈吉·查德（Sarah El Hajj Chehadeh） 1, 娜塔卡·德鲁蒙特 1, 杰瑞米·威利肯斯 1, 加拿大莱蒂蒂亚·罗谢尔 1, 伊莉丝·珍妮森（Elise Jeannesson） 1, Jean-Marc阿尔贝托 1, 杰恩·卢克·达瓦尔 1, Jean-Louis Guéant 1, 布里吉特·莱宁格·穆勒 2
附属公司

早期甲基供体缺乏改变雌性幼鼠小脑cAMP信号通路和神经鞘瘤发生

莎拉·埃尔·哈吉·查德（Sarah El Hajj Chehadeh）等。 美国生理内分泌代谢杂志. .

摘要

甲基供体叶酸和维生素B12的早期缺乏会导致妊娠期和哺乳期喂食甲基供体缺乏的饮食的21天大鼠幼崽出现高同型半胱氨酸血症以及认知和运动障碍。这些疾病与小脑的神经发生受损和突触可塑性改变有关。我们的目的是研究这些疾病是否与神经类固醇生成相关蛋白、关键调节受体和小脑中某些类固醇含量的表达受损有关。甲基供体缺乏导致叶酸和维生素B12浓度降低，同时同型半胱氨酸在两种性别的Purkinje细胞中积累，而S-腺苷蛋氨酸/S-腺苷高半胱氨酸比率仅在女性中降低。免疫组织化学显示，StAR、芳香化酶、ERα、ERβ和LH受体的转录水平和蛋白表达仅在雌性中降低，在浦肯野细胞中具有显著作用。一贯地，雌二醇和孕烯醇酮的降低水平仅在雌性小脑提取物中检测到。转录因子CREB、磷酸化CREB和SF-1的表达水平降低，cAMP浓度增加较少，且缺乏雌性小脑中磷酸化PKC的水平较低，表明通过与LHR激活相关的cAMP介导的信号通路激活神经类固醇生成将被改变。总之，妊娠期甲基供体缺乏会以性别依赖的方式损害小脑的神经类固醇生成。

关键词：小脑发育；循环AMP信号级联；早期甲基供体缺乏；神经甾体。

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数字

图1。
图1。
信号级联调节类固醇生成性急性调节（StAR）基因转录的示意图。黄体生成素（LH）与其受体的结合允许转录调控StAR公司该基因通过G蛋白/腺苷酸环化酶途径形成cAMP，进而激活蛋白激酶a（PKA）。这导致转录因子磷酸化结合到StAR公司基因启动子区。蛋白激酶C（PKC）也参与StAR的调节。促黄体激素受体；CREB、cAMP反应元件结合蛋白；SF-1，类固醇生成因子-1；ERα和β，雌激素受体-α和-β。经Manna等人（28）许可改编。
图2。
图2。
21日龄大鼠小脑中同型半胱氨酸（HCY）和雌二醇的免疫染色。A类：21天龄雌性大鼠小脑中HCY（绿色）的分布。用兔抗HCY多克隆抗体在矢状脑切片上对HCY阳性细胞进行免疫染色(n个=5/组）。用荧光染料4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）对细胞核进行复染。在缺陷组，在小脑浦肯野细胞中观察到HCY的强烈积聚。B类：DAPI（蓝色）复染小脑浦肯野细胞中雌二醇（绿色）的定位(n个=5/组）。ml，分子层；gl，颗粒层。校准棒，200μm。原始放大倍数，×20。
图3。
图3。
21日龄雌性大鼠小脑StAR蛋白和芳香化酶的表达。A类：蛋白质印迹分析。左侧：显示免疫可检测StAR蛋白的代表性Western blot集。从左到右，这些通道包含来自对照组（C）和缺陷组（D）21日龄大鼠小脑的线粒体（CER；30μg蛋白质）。成年大鼠的肺（30μg蛋白质）和成年大鼠的卵巢或睾丸（5或30μg蛋白质）分别作为阴性或阳性对照。StAR（30 kDa）的表达被量化，并与β-肌动蛋白（43 kDa。赖特：显示免疫可检测P450芳香化酶蛋白的代表性Western blot集。这些通道包含从21天龄C和D大鼠的CER（30μg蛋白质）中分离的微粒体。芳香化酶（55kDa）的表达被量化，并根据GAPDH（38kDa。密度测定数据来自5个单独的实验。结果显示为平均值±标准偏差。两个实验组之间的统计显著差异。B类：RT-定量（q）PCR分析饮食不足对21日龄大鼠小脑StAR和芳香化酶mRNA表达的影响。任意单位是指C和D动物CER中的内部标准(n个=5/组，重复运行）。两个实验组之间的统计显著差异：C类：免疫组化分析。与对照组大鼠相比，观察仅限于21天龄雌性大鼠早期接触缺陷饮食的Purkinje细胞(n个=5/组）。DAPI（蓝色）复染小脑浦肯野细胞中StAR（红色）和芳香化酶（绿色）的定位。校准棒，200μm。原始放大倍数，×20*P（P）<0.05（方差分析）。
图4。
图4。
21天大鼠雄性CER中神经类固醇生成关键蛋白的免疫染色。在矢状脑切片上对StAR、芳香化酶、ER受体、LHR和SF-1阳性细胞进行免疫染色(n个=5/组）。用荧光染料DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。在喂食缺陷饲料的母鼠中，对照组和缺陷幼鼠的表达没有显著差异。
图5。
图5。
21日龄雌性大鼠CER中ERα和ERβ受体的定位。A类：西部片分析。左侧：显示免疫可检测ERα蛋白的典型Western blot集。从左到右，这些通道包含从21天龄C和D大鼠的CER（50μg蛋白质）中分离的总蛋白质。赖特：显示免疫可检测ERβ蛋白的典型Western blot集。泳道包含从CER中分离的总蛋白质（50μg蛋白质）。ERα（66 kDa）和ERβ（55 kDa。密度测定数据来自5个单独的实验。结果以平均值±标准差表示。两个实验组之间的统计学显著差异：*P（P）<0.05（方差分析）。B类：免疫组化分析。与对照大鼠相比，早期暴露于缺陷饮食的21天大雌性的小脑浦肯野细胞的观察受到限制(n个=5/组）。ERα的定位（绿色；左边)和ERβ（绿色；正确的)DAPI（蓝色）复染CER的Purkinje细胞。校准棒，200μm。原始放大倍数，×20。
图6。
图6。
21日龄大鼠小脑中信号级联蛋白和cAMP浓度的分析。LHR的Western blot分析。显示免疫可检测LHR蛋白的典型Western blot集。LHR（80 kDa）的表达被量化，并与GAPDH（38 kDa。睾丸（5μg蛋白质）用作阳性对照。密度测定数据来自5个单独的实验。结果显示为平均值±标准偏差。两个实验组之间的统计显著差异。B类：LHR免疫染色。与对照组大鼠相比，21天龄雌性大鼠的小脑浦肯野细胞的观察结果受到限制(n个=5/组）。DAPI（蓝色）复染CER浦肯野细胞LHR（绿色）定位。校准棒，200μm。原始放大倍数，×20。C类：对照组和21天龄缺陷大鼠小脑提取物中的cAMP水平。结果显示为平均值±标准偏差。C和D幼崽在每种性别中的统计显著差异。天：雌性PKA、PKC和磷酸化PKC（pPKC）的Western blot分析(左边)和男性(正确的)小脑提取物。这些通道含有从21日龄C和D大鼠分离的总蛋白（40μg）。根据GAPDH（38 kDa）对每种感兴趣蛋白的表达进行量化和标准化。密度测定数据来自5个单独的实验。结果显示为平均值±标准偏差。两个实验组之间的统计显著差异*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（方差分析）。
图7。
图7。
转录因子CREB和SF-1在21日龄大鼠小脑中的表达水平。A类：显示免疫可检测的SF-1蛋白的一组代表性蛋白质印迹。这些通道包含从21日龄C和D大鼠的CER（30μg蛋白质）中分离的总蛋白质。SF-1（55 kDa）的表达被量化，并根据GAPDH（38 kDa。另外两条泳道含有从雌性和雄性下丘脑提取的蛋白质（30μg），用作阳性对照。从5个单独的实验中获得的密度测定数据。结果显示为平均值±标准偏差。两个实验组之间的统计显著差异。B类：RT-qPCR分析饮食不足对21日龄大鼠小脑SF-1 mRNA表达的影响。任意单位是指C和D类动物小脑中的内部标准(n个=5/组，重复运行）。两个实验组之间的统计显著差异。C类SF-1免疫组化染色。与对照组大鼠相比，观察仅限于21天龄雌性大鼠早期接触缺陷饮食的Purkinje细胞(n个=5/组）。DAPI（蓝色）复染CER浦肯野细胞中SF-1的定位。校准棒，200μm。原始放大倍数，×20。天：CREB和磷酸化CREB（p-CREB）蛋白质印迹分析。这些通道包含从21天龄C和D大鼠小脑分离的总蛋白（40μg蛋白质）。CREB和p-CREB的表达根据GAPDH（38 kDa）进行量化和标准化。从5个单独的实验中获得的密度测定数据。结果显示为平均值±标准偏差。两个实验组之间的统计显著差异*P（P）<0.05（方差分析）。
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