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.2014年11月；20(11):1270-8.
doi:10.1038/nm.3668。 Epub 2014年10月5日。

破骨细胞前体分泌的PDGF-BB在与成骨耦合过程中诱导血管生成

谢慧（音） 1, 庄翠（音） 2, 龙王 3, 朱英霞 1, 尹虎 1, 零陵县 4, 李长军 4, 梁燮 4, 珍妮特·克雷恩 4, 梅湾 4, 歌华镇 4, 秦边 4, 余斌（Bin Yu） 5, 张伟忠 4, 陶秋 4, 莫琳·皮卡斯基 6, Le Thi Duong公司 6, 乔琳·J·温德尔 7, 骆向航 8, 廖二元 8, 徐曹 4
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破骨细胞前体分泌的PDGF-BB在与成骨耦合过程中诱导血管生成

谢慧（音）等。 自然·医学. 2014年11月.

摘要

骨建模和重塑过程中的成骨作用与血管生成相耦合。最近的一项研究表明，一种对CD31和内黏蛋白（CD31（hi）Emcn（hi，hi））呈强阳性的特定血管亚型，能够促进血管生成和骨生成。在这里，我们发现破骨细胞前体分泌的血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）在骨建模和重塑过程中诱导CD31（hi）Emcn（hi。与野生型小鼠相比，抗酒石酸磷酸酯酶阳性细胞系中PDGF-BB缺失的小鼠的小梁和皮质骨量、血清和骨髓中PDGF-BB浓度显著降低，CD31（hi）Emcn（hi。在卵巢切除（OVX）诱导的骨质疏松小鼠模型中，PDGF-BB的血清和骨髓水平以及CD31（hi）Emcn（hi。用外源性PDGF-BB治疗或抑制组织蛋白酶K以增加破骨细胞前体的数量，从而增加PDGF-BB的内源性水平，增加CD31（hi）Emcn（hi。因此，增加破骨细胞前PDGF-BB分泌的药物治疗为通过促进血管生成从而促进骨形成治疗骨质疏松症提供了一个新的治疗靶点。

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数字

图1
图1
陷阱+细胞缺乏小鼠的皮质骨减少。(一)股骨的μCT图像。红色箭头表示皮质骨。比例尺，1 mm(b条)股骨骨小梁骨分数（Tb.BV/TV）、皮质厚度（CT.Th）和骨膜周长（Ps.Pm）的定量μCT分析。n个= 3. (c、 d日)TRAP染色图像(c（c）)骨膜表面破骨细胞数量的定量分析(d日)股骨干。黑色箭头表示视前病变。比例尺，500μm（顶部），20μm（底部）。n个= 5. (e、 （f）)细胞核CD31（红色）、Endomucin（绿色）和DAPI（蓝色）染色免疫染色的共焦图像(e（电子）)和定量分析(（f）)CD31和内皮粘蛋白（CD31）显著阳性的细胞数量你好Emcn公司你好，黄色）。虚线勾勒出骨骼表面。P、 骨膜；CB，皮质骨。比例尺，50μm。n个= 5. (g、 小时)TRAP染色图像(克)以及骨膜表面前破骨细胞（N.POCs）数量的定量分析(小时)不同年龄野生型雄性小鼠的股骨。比例尺，20μm。n个= 5. 数据显示为平均值±标准差*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01 (b条,d日,（f）t检验；小时，方差分析）。
图2
图2
破骨细胞前体分泌PDGF-BB，诱导MSCs和EPC迁移。(一)Transwell使用条件培养基（CM）对MSC的迁移进行分析，条件培养基来自不同的细胞培养物，有（+）或无（−）骨切片。(b条)如图所示，使用破骨细胞前体+骨片（POC-CM）条件培养基，加上个体中和抗体（Ab）、IgG或Noggin，进行Transwell MSC迁移分析；或使用破骨细胞+骨片（OC-CM）的条件培养基，并添加单独的中和抗体或IgG。(c、 d日)PDGF-BB浓度的ELISA分析(c（c）)和CTX(d日)在不同的条件培养基中。(e（电子）)不同条件培养基中PDGF-BB水平的免疫沉淀和免疫印迹分析。血小板：小鼠血小板裂解物（阳性对照）。(（f）)Transwell使用来自不同细胞培养物的条件培养基作为指示物或破骨前细胞+骨片（POC-CM）的条件培养液，加上IgG或PDGF-BB中和抗体FV，对EPC的迁移进行分析。视野（×200倍放大）。培养基控制：无血清α-MEM。Mo/Mac：单核细胞/巨噬细胞；POC：前斜长石；OC：破骨细胞。n个= 4. 数据显示为平均值±标准差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01（方差分析）。
图3
图3
破骨细胞前PDGF-BB基因敲除降低CD31你好Emcn公司你好血管和骨形成。(一)μCT图像和小梁骨分数（Tb.BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）、皮质厚度（CT.Th）和骨膜周长（Ps.Pm）的量化。比例尺，1 mm(b条)骨小梁（TB）和骨膜骨（PB）的钙化蛋白双重标记，并量化矿物并置率（MAR）和骨形成率（BFR）。比例尺，20μm。n个= 5. (c（c）)TRAP（红色）和PDGF-BB（绿色）免疫染色，并量化TRAP阳性细胞数量（N.TRAP+)每个骨骼表面（BS）。比例尺，50μm。(d日,e（电子）)血清CTX酶联免疫吸附试验(d日)，血清或骨髓（BM）PDGF-BB和VEGF浓度(e（电子）). (（f）)微灌注血管造影，量化血管体积和表面。比例尺，1 mm。n个= 5. (克)CD31（红色）和Endomucin（绿色）的免疫染色及CD31的定量你好Emcn公司你好骨髓和骨膜中的（黄色）细胞（P）（底部）。比例尺，50μm。(小时)流式细胞仪图（左）与CD31百分比（右）你好Emcn公司你好总骨髓细胞（BMC）中的细胞。n=4. (我)Endomucin（红色）和Ki67（绿色）免疫染色。(j个)骨钙素免疫染色（绿色）（左），骨钙素定量+TB和PB表面的细胞数（中间）。ELISA法测定血清骨钙素浓度（右）。比例尺，20μm。虚线勾勒出骨骼表面。DAPI染色（蓝色）细胞核。CB，皮质骨；骨髓。数据显示为平均值±标准差。n个=7−8，除非另有说明*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01与Pdgfb公司+/+(t吨测试）。
图4
图4
CTSK抑制剂增加TRAP+细胞PDGF-BB分泌偶联CD31你好Emcn公司你好血管与骨形成。(一)TRAP和PDGF-BB阳性细胞免疫染色定量（N.TRAP+PDGF-BB公司+)野生型骨小梁（TB）和骨膜（P）(Ctsk公司+/+)有或没有组织蛋白酶K抑制剂（L-235）或敲除(Ctsk公司–/–)老鼠。n个= 8. (b条)ELISA法测定血清和骨髓（BM）中PDGF-BB和VEGF的浓度。n个= 8. (c（c）)量化血管体积和表面。n个= 6. (d日)CD31（红色）和内粘蛋白（绿色）免疫染色，CD31定量你好Emcn公司你好（黄色）单元格。比例尺，50μm。n个= 8. (e（电子）)CD31的百分比你好Emcn公司你好流式细胞术检测总BM细胞中的细胞数。n个= 3. (（f）)酶联免疫吸附试验（ELISA）测定大鼠血清和骨髓中PDGF-BB和VEGF浓度Pdgfb公司–/–或Pdgfb公司+/+用载具或L-235治疗的室友。n个= 5. (克)量化血管体积和表面。n个= 5. (小时)CD31的量化你好Emcn公司你好TB（左）和P（中）的免疫染色。n个= 5. 增殖内皮细胞的内皮粘蛋白（红色）和Ki67（绿色）免疫染色（右）。(我)μCT定量皮质厚度（CT.Th）、骨膜周长（Ps.Pm）、小梁骨分数（Tb.BV/TV）和小梁厚度（Tb.Sh）。n个=5。(j个)通过ELISA测定血清骨钙素和CTX浓度。n个= 5. 虚线勾勒出骨骼表面的轮廓。DAPI染色（蓝色）细胞核。CB：皮质骨。数据显示为平均值±标准差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，NS，不显著（ANOVA）。
图5
图5
破骨细胞前条件培养液通过FAK的Akt依赖性磷酸化诱导MSCs和EPC形成管。(a、 b条)Matrigel试管形成分析图像(一)以及累计管长度的定量分析(b条)使用单核细胞/巨噬细胞（Mo/Mac）或破骨细胞前体（POC）条件培养基（CM）与MSC、EPC或两者共同培养，添加或不添加中和PDGF-BB抗体，如图所示。比例尺，200μm。(c、 d日)单用POC-CM处理5−60分钟的MSCs和EPC中PDGFRβ、PI3K、Akt和FAK磷酸化的Western blot(c（c）)，或加上各自的抑制剂(d日). (e（电子）)定量分析POC-CM诱导MSC和EPC共培养物与载体或各自抑制剂预孵育的基质凝胶管形成。(（f）)用载体或各自的抑制剂处理的MSC（左）或EPC（右）的POC CM诱导的迁移的Transwell分析。(g−i)Sphk1和β-肌动蛋白（顶部）的Western blot和POC分泌S1P浓度（底部）的质谱分析Pdgfb公司+/+或Pdgfb公司–/–接受或未接受野生型（WT）POC CM治疗的小鼠(克)，在不同的单元格中，如图所示(小时)，或在POC中Pdgfb公司–/–或Pdgfb公司+/+给予或不给予组织蛋白酶K抑制剂（L-235）治疗的小鼠(我). (j个)碱性磷酸酶活性（左）、茜素红S（ARS）染色（中）和基于ARS的MSCs基质矿化定量（右）用CM处理，如是否存在S1P受体拮抗剂VPC23019（VPC）所示。比例尺，100μm。OC：破骨细胞。n个= 6. 数据显示为平均值±标准差*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01（方差分析）。
图6
图6
增加PDGF-BB刺激CD31你好电子控制网你好OVX骨质疏松小鼠的血管和骨形成。(一)ELISA法测定假手术（sham）或卵巢切除小鼠（OVX）血清和骨髓（BM）中PDGF-BB和VEGF的浓度。(b条)血管体积和表面的量化。(c（c）)TRAP（红色）和PDGF-BB（绿色）免疫染色和TRAP定量+和TRAP+PDGF-BB公司+小梁（TB）和骨膜（PB）表面的细胞。(d日)CD31（红色）和内毒素（绿色）免疫染色和CD31定量你好Emcn公司你好骨髓和骨膜中的（黄色）细胞。比例尺，50μm。(e（电子）)ELISA法测定经载体、PDGF-BB或组织蛋白酶K抑制剂（L-235）治疗的OVX小鼠血清和骨髓中PDGF-BB和VEGF的浓度。(f、 克)血管体积和表面的量化(（f）)CD31的免疫染色你好Emcn公司你好单元格(克). (小时)结核和骨膜骨中矿物质同位率（MAR）和骨形成率（BFR）的量化。(我)通过ELISA测定血清骨钙素和CTX浓度。(j个)破骨前体分泌PDGF-BB模型，以耦合血管生成和成骨。在骨膜建模中，破骨细胞前PDGF-BB的分泌诱导CD31的形成你好Emcn公司你好血管刺激S1P分泌，促进成骨细胞分化。在小梁骨重塑中，CD31你好Emcn公司你好破骨细胞前分泌PDGF-BB诱导的血管改善了骨重塑过程中营养物质、氧气、矿物质和代谢废物的运输。虚线勾勒出骨骼表面。比例尺，50μm。数据显示为平均值±标准差a−d和小时 n个= 5; 对于e（电子）−克和我 n个= 10. *P（P）< 0.05, **P（P）<0.01（t检验和方差分析）。
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中的注释

  • 破骨祖细胞促进骨血管化和成骨。
    Kusumbe AP，Adams RH。 Kusumbe AP等人。 《国家医学》，2014年11月；20(11):1238-40. doi:10.1038/nm.3747。 《国家医学》，2014年。 PMID：25375923 没有可用的摘要。

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