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.2014年10月3日5:4904。
doi:10.1038/ncomms5904。

通过神经素-1启动并受营养物质可利用性调节的内吞途径

附属公司

通过神经素-1启动并受营养物质可利用性调节的内吞途径

洪博鹏等。 国家公社. .

摘要

神经纤毛蛋白(NRPs)是一种参与轴突引导和血管发育的跨膜受体。许多生长因子和其他信号分子通过羧基(C)末端的碱性序列基序(C末端规则或CendR基序)与NRP结合。具有此基序的肽(CendR肽)通过内吞作用进入细胞。肿瘤细胞介导的CendR肽穿透肿瘤组织,并在增强药物向肿瘤的传递方面显示出效用。在这里,我们通过RNAi筛选和后续验证研究表明,NRP1介导的CendR肽内吞与已知的内吞途径不同。在超微结构上,CendR内吞作用类似于大胞饮作用,但机制不同。我们还表明,营养敏感网络(如mTOR信号)调节CendR内吞和随后CendR货物的细胞间转运,这两者都受到营养物质消耗的刺激。由于CendR是一条整体运输途径,我们的结果表明它在营养物质运输中发挥作用;CendR-增强的药物传递随后利用了这种天然途径。

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利益冲突声明

其他作者没有透露任何潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。基因组RNAi筛选概述
(A) 基因组筛查和个体siRNA测试的工作流程方案。(B) 基因组筛查结果概述。为每个人确定稳健的Z评分方法中所述和补充数据1中所列的筛选基因。Z分数被划分分为不同的区域,x轴上的值表示每个区域的最小值区域。每个Z值区域中的基因数量显示在y轴上。阴性(NSsiRNA)和阳性(NRP1 siRNA)对照分别以蓝色和红色显示基因组基因是黄色的。(C) 稳健的Z评分与细胞活力无关。生成活细胞计数如方法所述,并在补充数据1中列出。稳健的Z分数显示在y轴上,并且可行细胞在x轴上计数。上部面板仅显示负极(蓝色)和正极(红色)控件。下部面板包括所有测试的基因组基因(黄色)。虚线线表示用于消除基因的截止值(活细胞数>50)其敲除引起细胞毒性。水平方向上Z分数的分布线显示,评分与细胞毒性无关。(D) 验证选定基因的基因组文库siRNA对R-Ag摄取的影响。PPC1细胞用来自基因组筛选文库的合并siRNA处理基因(x轴)。每个细胞的相对mRNA表达水平和R-Ag摄取量为按照方法中所述进行量化,并归一化为阴性对照(NS siRNA处理过的细胞),如y轴所示。误差条表示三个独立的SEM实验。
图2
图2。CendR内吞作用在机制上与已知的内吞途径不同
(A) 敲除基因组筛选中的hit基因对R-Ag和TF的影响使用单个siRNAs格式摄取。这些值表示相对探针摄取量归一化为阴性对照(即1,补充数据2)。热图和使用Gene-E(Broad institute)进行聚类分析。(B) R-Ag摄取不受Cav-ME和MP抑制剂的影响。PPC1细胞用指示抑制剂(mβCD或Rottlerin),然后测试探针摄取(R-Ag、CtxB或Dex),如方法所述。每个探针的荧光强度为归一化为相应阴性对照(仅车辆)的平均值相对摄取(y轴)*P<0.05和**P<0.01(学生的t检验)。(C) CendR货物不与其他内吞途径竞争。未标记的CendR肽,RPARPAR-OH以指定浓度添加到PPC1细胞的培养基中(右上角)添加荧光标记的内吞探针前10分钟(x轴)。探针信号强度标准化为未处理细胞的平均值(0μM)作为相对摄取量(y轴)。(D) R-Ag不与CME和Cav-ME囊泡的结构成分共定位。PPC1细胞在洗涤前用R-Ag、TF-594或CtxB(红色)培养15分钟固定。用兔抗CLTC和抗CAV1检测CLTC和CAV1蛋白抗体,然后用抗兔二级抗体(绿色)染色。Nuclei是用Hoechst 33342(蓝色)标记。共焦显微镜拍摄的代表性图像如图所示。两个探针之间的共定位事件用图像J的“同位荧光笔”宏,以黄色显示。比例巴,10μm。误差条表示SEM(3-5个重复)。
图3
图3。NRP1结合下游的CendR内吞需要GIPC1/synectin
(A) NRP1-GIPC1/连接蛋白相互作用对CendR的内化很重要肽进入细胞。用表达野生型(WT)的质粒转染HeLa细胞方法中描述的NRP1或NRP1ΔSEA突变。48小时后添加R-Ag(红色)并与细胞在37°C下孵育2小时。然后对细胞进行蚀刻或清洗两次使用PBS,无需蚀刻,固定并染色细胞表面NRP1(绿色)。用Hoechst 33342(蓝色)染色。进行了三项独立实验显示了具有代表性的图像。比例尺,10μm。(B) 定量(A)中的R-Ag摄取。R-Ag的荧光强度对(A)中NRP1阳性HeLa细胞进行定量,并将其归一化为WT的平均值NRP1-将样品表示为相对摄取量(y轴)。作为比较,PPC1细胞用NS或GIPC1/synectin siRNA处理,然后用R-Ag孵育1小时方法中所述的蚀刻。每个细胞的R-Ag信号被量化并标准化为NS处理样品的平均值作为相对摄取量(y轴)*P<0.05(学生的t检验)。(C) 非CendR内吞探针的细胞摄取不需要GIPC1/synectin。用阴性对照siRNA(NS)或靶向GIPC1/synectin的siRNA治疗后如方法所述,测量PPC1细胞对CtxB或Dex的摄取。荧光每个细胞的每个探针的强度归一化为相应的平均值阴性对照(NS siRNA处理)作为相对摄取(y轴)。误差条表示SEM(3-6次重复)。
图4
图4。CendR介导的细胞摄取受营养物质可用性的调节
(A) 使用IPA对基因组屏幕点击进行网络分析。与相关的顶级路径基因组点击(补充数据1) 显示了相应的p值(通过IPA计算)。(B) 营养条件和其他刺激物对R-Ag吸收的调节。如图所示的处理(x轴),PPC-1细胞与R-Ag孵育方法。每个细胞内化R-Ag的平均强度归一化为细胞在完全培养基中培养,显示为相对摄取(y轴)。(C) 通过营养剥夺刺激R-NA摄取。经过指定的处理(x轴),用R-NA培养PPC1细胞,如方法所述。平均值每个细胞内化R-NA的强度标准化为在完全培养基中培养的细胞作为相对摄取(y轴)。(D) R-Ag和其他内吞探针对环境信号的反应不同。指示的处理,PPC1细胞与不同的内吞探针(上部右面板)进行内部化,如方法中所述。荧光强度每个探针在指定的条件下(x轴)被归一化为培养在完全培养基作为相对摄取(y轴)。误差条表示SEM(3-5个重复)*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001(学生t检验)与相应的完整媒体条件进行比较探针。
图5
图5。CendR肽启动类似大胞饮作用的NRP1依赖性内吞过程
(A) PPC1细胞在完全、无AA-或无葡萄糖培养基中培养16 h,然后用R-Au(致密点,50 nm)培养30分钟并固定。代表显示了细胞内位置的TEM图像。(B) 含有R-Au(50 nm)的细胞内细胞器的典型TEM图像内体和MVB的特征。(C) CendR内吞作用的NRP1依赖性。未转染或转染NRP1的HeLa细胞表达质粒(NRP1 WT或ΔSEA)与R-Au(密集点,50nm)一起孵育固定前30分钟。显示了典型的TEM图像。比例尺,200 nm。
图6
图6。CendR货物的细胞间运输对养分可用性的响应
(A) 营养剥夺刺激了细胞间R-Ag转移。PPC1细胞与R-Ag孵育2小时内化。蚀刻后,收集细胞(供体细胞),并与PBS中的PPC1-GFP细胞(受体细胞)混合(pH=7.4)。细胞然后将混合物作为单层接种在完全培养基中(完全,附着),或作为完整、无AA-或无葡萄糖培养基中的球体。16小时后,收集细胞,R-Ag转移按方法中所述进行量化,并归一化为“完整球体”,设置为1。(B) 营养调控仅适用于CendR的细胞间转运肽。监测细胞内指示探针(x轴)的细胞间转运如(A)所述,在完全和无AA-介质中生长为球体。R-Ag比率转移(无AAvs.完全转移)表示营养素消耗的刺激程度(y轴)。(C) 细胞间运输受到细胞外腐蚀的保护。R-Ag转移按照(A)所述,在保存在无AA-介质中的球体中进行监测,有或没有常数方法中所述的蚀刻处理。恒定刻蚀下的R-Ag转移值将条件归一化为无刻蚀条件,并在y轴上列出。误差条表示SEM(3-5个重复)。ns(不显著),*P<0.05和**P<0.01(学生t检验)相比相应探针的完整球体条件。
图7
图7。生理环境下CendR摄取的营养调节
(A) 活肿瘤切片中的CendR摄取对营养物质的可用性有反应。活肿瘤获得组织切片(PPC1异种移植物;4T1小鼠乳腺肿瘤)并孵育在指定的条件下(y轴)放置6小时。然后将切片悬浮在含有15 pM R-Ag的同种培养基,在37°C,在蚀刻和固定之前在摇杆上轻轻摇晃。荧光使用ImageJ量化每个细胞的R-Ag强度,并将其归一化为培养在完全培养基,显示为相对摄取(x轴)**P<0.01和***P<0.001(学生t检验)与相应肿瘤类型的完整培养基条件。误差条表示SEM(4-7复制)。(B) PPC1肿瘤切片中R-Ag内化的代表性图像。R-Ag,红色;细胞核,蓝色。比例尺,50μm。(C) GLUT IV抑制剂对4T1肿瘤葡萄糖摄取的代表性图像治疗。携带4T1肿瘤的小鼠通过瘤内注射载体进行治疗方法中所述的GLUT IV抑制剂。IRDye 800CW 2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)然后将100μl PBS中的10 nmol静脉注射到尾静脉中,24小时随后,使用Xenogen IVIS 200成像仪捕获2-DG的荧光强度(PerkinElmer公司)。实验进行了两次,每个实验至少有三只小鼠组。(D) 肿瘤中iRGD的积累对葡萄糖剥夺有反应。FAM公司静脉注射(荧光素)标记的iRGD(100μl PBS中200μg)将其注射到携带4T1肿瘤的小鼠体内,这些小鼠接受单独载体或GLUT IV治疗抑制剂。循环2小时后,向小鼠灌注含有1%的PBSBSA去除循环中残留的肽。肿瘤被切除、固定分段。用兔抗FITC抗体检测肿瘤中的FAM-iRGD。平均值将每个细胞的信号强度标准化为车辆治疗肿瘤的相对摄取量。这个实验进行了两次,每组至少有三只小鼠,误差条显示SEM.*P<0.05(学生t检验)。

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引用人

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