Pancreatic and duodenal homeobox protein 1 (Pdx-1) maintains endoplasmic reticulum calcium levels through transcriptional regulation of sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2b (SERCA2b) in the islet β cell

doi:10.1074/jbc.M114.575191

.2014年11月21日；289(47):32798-810.

doi:10.1074/jbc。M114.575191。 Epub 2014年9月30日。

胰腺和十二指肠同源盒蛋白1（Pdx-1）通过转录调节胰岛β细胞中的肌-内质网钙ATP酶2b（SERCA2b）来维持内质网的钙水平

贾斯汀·约翰逊¹, 河野达辅², 新通^三, 山本和太郎^三, 安吉尔·扎兰·赫尔茨伯格（Angel Zarain-Herzberg）⁴, 马修·梅林⁵, Leslie S缎子⁶, 帕特里克·吉隆⁷, 卡梅拉·埃文斯·莫利纳⁸

附属公司

¹来自生物化学系和分子生物学系。
²医学和。
^三细胞和综合生理学。
⁴墨西哥国立自治大学医学院生物医学系，墨西哥市，邮编04510。
⁵威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学麦迪逊医学与公共卫生学院医学系内分泌、糖尿病和代谢科和生物分子化学系，邮编53705。
⁶密歇根大学医学院药理学系和布雷姆糖尿病研究中心，密歇根州安阿伯48105。
⁷1348年比利时布鲁塞尔鲁汶天主教大学研究所内分泌与营养研究所。
⁸来自印第安纳州印第安纳波利斯市印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学、医学、细胞和综合生理学系以及赫尔曼·B·威尔斯儿科研究中心，印第安纳州46202cevansmo@iu.edu。

PMID： 25271154
预防性维修识别码：项目经理4239629
内政部： 10.1074/jbc。M114.575191美元

胰腺和十二指肠同源盒蛋白1（Pdx-1）通过转录调节胰岛β细胞中的肌-内质网钙ATP酶2b（SERCA2b）来维持内质网的钙水平

贾斯汀·约翰逊等。生物化学杂志. 2014.

.2014年11月21日；289(47):32798-810.

doi:10.1074/jbc。M114.575191。 Epub 2014年9月30日。

作者

贾斯汀·约翰逊¹, 河野达辅², 新通^三, 山本和太郎^三, 安吉尔·扎兰·赫尔茨伯格（Angel Zarain-Herzberg）⁴, 马修·梅林⁵, 莱斯利·萨廷⁶, 帕特里克·吉隆⁷, 卡梅拉·埃文斯·莫利纳⁸

附属公司

¹来自生物化学和分子生物学系。
²医学和。
^三细胞和综合生理学。
⁴墨西哥国立自治大学医学院生物医学系，墨西哥市，邮编04510。
⁵威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学麦迪逊医学与公共卫生学院医学系内分泌、糖尿病和代谢科和生物分子化学系，邮编53705。
⁶密歇根大学医学院药理学系和布雷姆糖尿病研究中心，密歇根州安娜堡48105。
⁷1348年比利时布鲁塞尔鲁汶天主教大学研究所内分泌与营养研究所。
⁸来自印第安纳州印第安纳波利斯市印第安纳大学医学院生物化学和分子生物学、医学、细胞和综合生理学系以及赫尔曼·B·威尔斯儿科研究中心，印第安纳州46202cevansmo@iu.edu。

PMID： 25271154
预防性维修识别码：项目经理4239629
内政部： 10.1074/jbc。M114.575191号

摘要

虽然已知胰腺十二指肠同源盒1（Pdx-1）转录因子在β细胞发育和分泌功能中起着不可或缺的作用，但最近的数据也表明Pdx-1在维持内质网（ER）健康中起着重要作用。肌-内质网Ca（2+）ATP酶2b（SERCA2b）泵在胞浆和内质网腔之间维持一个陡峭的Ca（2+）梯度。在糖尿病模型中，我们的数据显示β细胞Pdx-1的缺失与SERCA2b表达的改变并行发生，而在SERCA2b启动子的电子分析中显示了多个假定的Pdx-1结合位点。我们假设，在炎症和糖尿病条件下，Pdx-1缺失会导致SERCA2b水平和活性降低，并伴随ER健康状况的改变。为了测试这一点，在INS-1细胞中进行了siRNA介导的Pdx-1的敲除。结果显示，SERCA2b表达降低，ER-Ca（2+）降低，这是用荧光寿命成像显微镜测量的。与空白载体对照相比，将人Pdx-1与人SERCA2启动子融合的报告子共转染后，荧光素酶活性增加了3-4倍，染色质免疫沉淀证实Pdx-1与近端SERCA2基因启动子直接结合。为了确定SERCA2b的恢复是否可以缓解Pdx-1缺失引起的内质网应激，Pdx1（+/-）小鼠被喂以高脂肪饮食。与野生型对照组相比，分离的胰岛显示出增加的剪接与总Xbp1比率，而SERCA2b过度表达降低了Xbp1的比率。总之，这些结果确定SERCA2b是Pdx-1的一个新的转录靶点，并定义了在Pdx-1缺陷状态下ER-Ca（2+）调节改变的作用。

关键词：钙ATP酶；糖尿病；内质网应激；胰腺和十二指肠同源框1；胰岛；肌内质网钙ATP酶；β细胞。

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数字

**图1。**
**在糖尿病应激条件下，β细胞中Pdx-1和SERCA2b水平平行降低。** A类和B类，从12周龄C57BLKs/J-db/db中分离出蛋白质和RNA(*分贝/分贝*)和同卵杂合控制(*数据库*+)小鼠胰岛。使用针对SERCA2、Pdx-1和肌动蛋白的抗体进行免疫印迹分析，并对反转录RNA进行实时定量RT-PCR，以测量SERCA2b和Pdx-1转录水平。*C–E类*，INS-1 832/13大鼠胰岛素瘤细胞用25 m米葡萄糖和5 ng/ml IL-1β(*HG公司*+*白介素-1*β）持续16和24小时。C类，使用SERCA2、Pdx-1和肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。D类，定量蛋白质水平以图表形式显示。E类对逆转录RNA进行实时PCR，以量化SERCA2b、Pdx-1、胰岛素前体和GAPDH转录水平。F类使用最佳拟合线绘制尸体人类胰岛中Pdx-1和SERCA2b mRNA的水平。所示比较有显著差异。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01 (n个=至少6，除A类，其中n个=来自三个生物复制品的100个胰岛的2个样本）。结果显示为平均值±S.E。

**图2。**
**从Pdx-1单倍体小鼠分离的胰岛中SERCA2b减少。**Pdx-1单倍体小鼠(*第1页*^+/负极)和野生型室友(重量)被喂食的是含有17%千卡脂肪的正常饮食。A类和B类，腹腔葡萄糖耐量试验(*独立发电机组*)在11周龄时在Pdx-1进行^+/负极和WT小鼠，曲线分析下的面积以图形显示。*C–E类*从13周龄的Pdx-1单倍体小鼠和WT同窝对照小鼠胰岛中分离出蛋白质和RNA。C类使用SERCA2、Pdx-1和GAPDH抗体进行免疫印迹分析。D类，定量蛋白质水平以图表形式显示。E类对逆转录的胰岛RNA进行实时定量RT-PCR，以量化SERCA2b和Pdx-1。所示比较有显著差异。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01 (n个=3–10，用于腹腔葡萄糖耐量试验，以及n个=免疫印迹和定量RT-PCR至少4）。结果显示为平均值±S.E。

**图3。**
**Pdx-1过度表达增加了SERCA2的表达，而Pdx-1敲除降低了SERCA2b的水平*在体外*.** A类和B类，Pdx-1通过腺病毒转导在缺乏Pdx-1天然表达的NIH-3T3小鼠成纤维细胞中过表达，并且使用针对SERCA2、Pdx-1和肌动蛋白的抗体进行免疫印迹分析。*C–E类*，用表达抗Pdx-1 siRNA的腺病毒转导INS-1细胞。C类，使用SERCA2、Pdx-1和肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析。D类，定量蛋白质水平以图表形式显示。E类对RNA进行实时定量RT-PCR，以量化SERCA2b和Pdx-1转录水平。所示比较有显著差异。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01 (n个=至少4）。结果显示为平均值±S.E。

**图4。**
**Pdx-1敲除降低了β细胞内质网钙水平。**用D4ER-Ca转导INS-1细胞²⁺报告型腺病毒与表达siPdx-1或随机siRNA的腺病毒结合。FLIM用于测定内质网Ca²⁺.A类，随机siRNA和Pdx-1 siRNA处理细胞平均供体寿命的代表性显微照片。B类随机siRNA和siPdx-1处理的INS-1细胞中的振幅加权供体荧光寿命按照“实验程序”进行量化C类，随机siRNA-处理的INS-1细胞中的供体荧光寿命的振幅加权值在基线时和用thapsigargin治疗2分钟后进行量化(n个=在三个独立实验中，每个治疗至少量化26个感兴趣区域B类和C类). 结果显示为平均值±S.E。所示比较有显著差异。**，第页< 0.01).

**图5。**
**Pdx-1敲除改变了β细胞钙稳态。** A类，以评估基础细胞溶质钙²⁺按照“实验程序”中的描述，在未经处理的INS-1细胞和用表达siPdx-1或随机siRNA的腺病毒转导的INS-1细胞中测量Fura-2/AM荧光比率。*B–F类*用10 m米咖啡因或1μ米thapsigargin测定Pdx-1敲除对ER-Ca的影响²⁺储存和胞浆钙²⁺ER Ca之后的运输²⁺消耗。B类，根据公式ΔF/F0，数据被描述为标准化比率。C类和E类，代表性Fura-2/AM-Ca²⁺用咖啡因录音(C类)和萨普西加金(E类)在siPdx-1或随机siRNA-转导的INS-1细胞中进行治疗。各组的计算ΔF/F0如图所示D类和F类在三个独立的实验中，从至少120个感兴趣的区域收集了Fura-2/AM比率。结果显示为平均值±S.E.，所示的比较有显著差异。**，第页< 0.01.

**图6。**
**Pdx-1增强SERCA2启动子活性。** A类，在人类SERCA2启动子中鉴定出五个推测的Pdx-1结合区域。B类，NIH-3T3小鼠成纤维细胞与荧光素酶上游的人SERCA2启动子缺失结构共同转染(吕克)编码区，并转染人Pdx-1或空载体控制质粒。报告者分析按照“实验程序”中的概述进行C类，描述了为删除最接近的Pdx-1结合元件而采取的突变策略。人类、大鼠和小鼠启动子之间存在同源性。D类，将NIH-3T3细胞与野生型或突变构建体与Pdx-1质粒或空载体对照共同转染，并进行报告基因测定(n个=至少5个独立实验，样品分析一式三份）。结果显示为平均值±S.E。所示比较有显著差异。**，第页<0.01；*不另说明。*，不显著。

**图7。**
**Pdx-1直接与近端SERCA2启动子结合。**采集INS-1细胞并进行ChIP分析。定量PCR用于测量*血清钙*或*INS1公司*用抗Pdx-1抗体或正常兔IgG免疫沉淀后的启动子。结果表示为与兔IgG相比，目标基因回收率增加了一倍，并表示三个独立实验的平均值±S.E。所示比较有显著差异。*，第页< 0.05.

**图8。**
**重组SERCA2表达可改善从喂养高脂肪饮食的Pdx-1单倍体小鼠分离的胰岛中的内质网应激。**Pdx-1单倍体(*第1页*^+/负极)给小鼠或野生型同窝小鼠喂食正常的食物(数控)或在胰岛分离前8周内摄入含有45%千卡脂肪的HFD。A类实时RT-PCR用于定量从喂食NC或HFD的WT同窝对照小鼠分离的胰岛中Pdx-1和SERCA2b转录水平。*B–E类*，从13周龄的Pdx-1中分离出蛋白质和RNA^+/负极WT窝鼠控制胰岛。B类使用SERCA2、Pdx-1和GAPDH抗体进行免疫印迹分析。C类，定量蛋白质水平以图表形式显示。*D–E*对逆转录RNA进行实时PCR，以量化Pdx-1、SERCA2b、总转录水平和剪接Xbp1转录水平。拼接到总Xbp1的比率如所示*D.E公司*免疫印迹分析显示，从Pdx-1分离的胰岛中成功的腺病毒过表达SERCA2b^+/负极小鼠和WT室友对照组喂食HFD。*G公司*，Pdx-1分离胰岛中Xbp1 mRNA剪接与未剪接比率的量化^+/负极和WT小鼠喂食HFD并进行治疗体外无病毒或用SERCA2b腺病毒或表达LacZ的对照病毒转导(n个= 12–18). 结果显示为平均值±S.E。所示比较有显著差异。*，第页< 0.05; **,第页<0.01；*不另说明。*，不重要。

**图9。**
**SERCA2b过度表达导致葡萄糖刺激的Ca改善²⁺喂食高脂肪饮食的Pdx-1单倍体小鼠的胰岛反应。**从Pdx-1分离的岛屿^+/负极喂食高脂肪饮食8周的小鼠被转导体外带有表达SERCA2b或LacZ的腺病毒。A类，代表性Fura-2/AM-Ca²⁺在2.5米处进行成像记录米葡萄糖和20m的后续刺激米葡萄糖。B类，根据公式ΔF/F0对数据进行分析，并以图形方式显示结果。从每个胰岛至少两个感兴趣的区域测量Fura-2/AM比率，并从至少三个生物复制品中分离胰岛。结果显示为平均值±S.E。所示比较有显著差异。**，第页< 0.01.

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