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.2014年12月；20(12):1045-55.
doi:10.1111/cns.12325。 Epub 2014年9月17日。

脑卒中延迟性神经元死亡中BNIP3与LC3相互作用引发过度线粒体自噬

若阳石 1, 圣华珠, 李泽钜, 斯宾塞·B·吉布森, 许兴顺, Ji-Ming Kong公司
附属公司

脑卒中迟发性神经元死亡中BNIP3与LC3相互作用引发过度的有丝分裂

若阳石等。 CNS神经科学疗法. 2014年12月.

摘要

简介：在生理条件下，基本水平的有丝分裂对线粒体质量控制至关重要，而在包括缺血性中风在内的许多疾病中，过度有丝分裂会导致细胞死亡。调节这一过程的信号仍然未知。BNIP3是一种仅促凋亡BH3蛋白，被认为是有丝分裂的调节器。

目的：本研究中使用了体内和体外中风模型，以及BNIP3野生型和敲除小鼠。

结果：我们发现BNIP3及其同源物BNIP3L（NIX）以“延迟”方式高度表达，并导致中风后延迟性神经元丢失。BNIP3缺乏显著降低了神经元的有丝分裂和凋亡，但增加了缺血/缺氧损伤后的非选择性自噬。线粒体定位的BNIP3与自噬体放大的LC3相互作用，表明BNIP3类似于NIX，在线粒体上作为LC3结合受体发挥作用。虽然当BNIP3沉默时NIX表达上调，但NIX上调不能在功能上补偿BNIP3在激活过度的有丝分裂中的丢失。

结论：NIX主要在生理条件下调节有丝分裂的基础水平，而BNIP3只会激活过度的有丝分裂，导致细胞死亡。

关键词：BNIP3；LC3；线粒体自噬；NIX；新生儿中风。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
BNIP公司3基因沉默在中风模型中具有神经保护作用。脑梗塞体积的测量BNIP公司三重量和击倒对手新生鼠脑卒中模型。双向方差分析分析和B类onferroni后测试用于比较两组患者的总脑梗死体积重量和击倒对手组：重量与击倒对手在每个时间点***P（P）< 0.001. 对照组为假手术组，未接受I/H治疗。每组N=3–6(A类,B类). 年细胞死亡率的时间进程OGD公司/RP公司面临挑战BNIP公司三重量和击倒对手神经元，量化乳酸脱氢酶化验。使用双向方差分析和Bonferroni后验来比较重量和击倒对手组：重量与击倒对手在每个时间点**P（P）< 0.01，以及***P（P）< 0.001. 对照组没有I/H。每组N=3(C类).
图2
图2
BNIP公司3在脑卒中模型中表达增加了线粒体吞噬功能。免疫细胞化学用于检测重量/击倒对手线粒体与自噬体共定位显示。线粒体用红色、LC3染色，细胞核分别用绿色和蓝色标记。比例尺=30μm.在63倍物镜下拍摄图像(A类,B类). 线粒体与自噬体共定位率OGD公司/RP公司计算处理过的神经元。双向ANOVA分析和Bonferroni后测用于比较重量和击倒对手组：重量与击倒对手在每个时间点*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01，以及***P（P）< 0.001. 每组N=3(C类). Western blot用于测定线粒体标记蛋白的表达水平在体外(D类)和体内(E类). β‐肌动蛋白（43 kDa）被纳入内部控制。使用Quantity One软件测量带密度。使用双向方差分析和Bonferroni后验来比较重量和击倒对手组：重量与击倒对手在每个时间点上*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01，以及***P（P）< 0.001. 对照组无I/H损伤。每组N=3。一组电子显微照片（a–k）显示OGD公司/RP公司受伤(F类). 白色方框突出显示自噬体，黑色箭头表示自噬空泡，黑色箭头表明线粒体肿胀和扩张OGD公司6小时以上RP公司72小时处理(b条–d日,（f）和k个，如白色方框所示）。对照神经元中正常大小的健康和功能性线粒体染色变暗(一,e（电子）,克、和小时，如黑框所示）。溶酶体被激活并与自噬体融合(（f）和k个（如白色方框内所示）。N=核；(c（c）)和(d日)显示自噬体增大(b条); (克)和(小时)显示线粒体增大，外观正常(e（电子）); (我)和(j个)显示线粒体肿胀扩张(（f）); (k个)显示一个扩大的自体溶酶体，包裹着内线粒体(（f）)展示了正在进行的有丝分裂过程。比例尺=2μm英寸(一,b条)，比例尺=500 nm in(e（电子）–（f）). 每组N=3。
图3
图3
的表达模式BNIP公司3和NIX公司在中风模型中。初级皮层神经元用OGD公司持续6h，然后再灌注不同时间（24、48和72h）。BNIP公司三重量和击倒对手对幼鼠进行新生期中风建模，然后恢复1、3或7天。Western blot用于显示BNIP公司3和NIX公司表达在体外(A类)和体内(B类). 使用Quantity One软件测量带密度。使用双向方差分析和Bonferroni后验来比较重量和击倒对手组：重量与击倒对手在每个时间点*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01，以及***P（P）< 0.001. 对照组为无I/H损伤的假手术组。每组N=3。
图4
图4
线粒体局限性BNIP公司3在中风模型的神经元有丝分裂中与LC3相互作用。蛋白质-蛋白质之间的相互作用NIX公司和LC3，以及BNIP公司3和LC3在体内和体外中风模型，分别(A类–C类). 对照组验证了免疫共沉淀分析中使用的每种主要抗体的特异性和效率(A类). 阳性对照组证实了NIX公司中风模型中的LC3(B类). 实验组证实了BNIP公司中风模型中的3（60kDa同二聚体形式）和LC3(C类). 使用co-IP和ELISA分析NIX公司和LC3，以及BNIP公司在每个时间点进一步量化3和LC3(D类–G公司). 单向方差分析和D类使用unnett的后验进行统计分析*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01，以及***P（P）< 0.001与对照组。对照组和假手术组没有I/H。每组N=3。
图5
图5
BNIP公司3基因沉默减少了皮层神经元的凋亡并增加了一般自噬OGD公司/RP公司受伤。凋亡减少通过促凋亡蛋白（caspase 3，行李细胞色素c）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）BNIP公司三击倒对手神经元(A类). 通过自噬标记蛋白（Beclin1、LAMP‐2和LC3‐II/I比率）的表达增加来量化一般自噬的增加BNIP公司三击倒对手神经元(B类). β‐肌动蛋白（43 kDa）被纳入内部控制。使用Quantity One软件测量带密度。使用双向方差分析和Bonferroni后验来比较重量和击倒对手组：重量与击倒对手在每个时间点*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01，以及***P（P）< 0.001. 每组N=3。
图6
图6
BNIP公司3基因沉默增加了OGD公司/RP公司激发神经元。免疫细胞化学用于证明BNIP公司3和LC3蛋白的加工和移位（标点染色）。BNIP公司3用红色染色，LC3和细胞核分别用绿色和蓝色标记。比例尺=30μm.在63倍物镜下拍摄图像(A类,B类).MDC公司测量荧光以量化细胞自噬的一般强度BNIP公司三重量和击倒对手神经元。使用双向方差分析和Bonferroni后验来比较重量和击倒对手组：重量与击倒对手在每个时间点***P（P）< 0.001. 每组N=3(C类). 溶酶体与体内自噬体的共定位BNIP公司三重量和击倒对手检测到神经元。溶酶体用红色染色，LC3和细胞核分别用绿色和蓝色标记。比例尺=30μm.在63倍物镜下拍摄图像(D类,E类). 不带的对照组OGD公司/RP公司.
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