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.2014年11月1日；20(21):5435-45.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-0542。 Epub 2014年9月15日。

脱氧胞苷激酶表达支持吉西他滨治疗膀胱癌的疗效

马丁·科尔 1, 海伦·E·斯科特 2, 布拉斯·格罗塞尔吉 1, 迈克尔·R·L·斯特拉福德 1, 卡塔琳·卡拉西 2, 娜奥米·夏尔马 2, 安妮·基尔蒂 三
附属机构

脱氧胞苷激酶表达支持吉西他滨治疗膀胱癌的疗效

马丁·科尔等。 临床癌症研究. .

摘要

目的：在最近的一项II期临床试验中，低剂量（100 mg/m（2））吉西他滨有望成为膀胱癌的放射增敏剂，但其潜在机制尚不明确。在这里，我们研究了低剂量吉西他滨对膀胱癌细胞系放射增敏的机制。

实验设计：使用克隆形成试验，通过低剂量吉西他滨筛选四种膀胱癌细胞系的放射增敏作用，以及通过暴露于增加的吉西他宾剂量而产生的吉西他耐药RT112gem和CALgem细胞。四个关键的吉西他滨调节基因被瞬时siRNA敲除。携带CALgem皮下异种移植物的裸鼠暴露于100 mg/kg吉西他宾±电离辐射（IR），并通过肿瘤生长延迟评估反应。

结果：吉西他滨在四种膀胱癌细胞系中具有低纳米摩尔范围（10-40 nmol/L）的细胞毒性，并且对所有四种细胞系都具有放射增敏作用。10%存活率时的增敏率为：RT112 1.42、CAL29 1.55、T24 1.63和VMCUB1 1.47。脱氧胞苷激酶（dCK）的短暂siRNA敲低显著降低了吉西他滨的放射增敏作用（P=0.02）。RT112gem和CALgem细胞显示dCK mRNA和蛋白水平显著下降；dCK的再次表达恢复了吉西他滨的敏感性。然而，CALgem异种移植物对吉西他滨/IR联合治疗的反应优于单独治疗（P<0.001），其中dCK在肿瘤血管和基质中强烈表达。

结论：膀胱癌细胞系中的吉西他滨耐药与dCK表达降低有关，但对吉西他宾耐药的异种移植物对低剂量吉西他比/IR联合用药有反应。我们认为肿瘤血管中的dCK活性使其对吉西他滨敏感，这足以激发肿瘤反应，并在耐药肿瘤中杀死肿瘤细胞。

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数字

图1
图1。低剂量吉西他滨是膀胱癌细胞的放射增敏剂。
A） 克隆形成试验以确定吉西他滨在一组膀胱癌细胞系中的细胞毒性。根据细胞系的不同，在每皿600-2000个细胞电镀之前，用20 nM吉西他滨处理次级流入细胞，2周后测量集落形成。B） 与吉西他滨摄取和代谢有关的蛋白质的Western blots（n=3）。用20 nM吉西他滨处理RT112、CAL29、T24和VMCUB1膀胱癌细胞株24 h，适当时用5 Gy IR处理，处理后2 h收集RRM1和RRM2、hENT1、CDA和dCK的免疫印迹。通过对总H2AX的印迹证实了等负荷，通过对γH2AX的印迹证实了DNA损伤。C） 细胞按A）处理，然后在电镀后立即用IR处理。在电镀后2周计数菌落。D） 10%存活率时的增敏率。使用双向方差分析计算比较的P值，如下所示：RT112:UT vs 10 nM gem P=0.008，UT vs.20 nM gem P<0.0001；CAL29:UT对10 nM宝石P=0.004，UT对20 nM P<0.0001；T24:UT对10 nM宝石P=0.002，UT对20 nM宝石P<0.0001；VMCUB1:UT对10 nM宝石P=0.315，UT对20 nM宝石P=0.0013。E） dCK蛋白水平与SER的相关性。通过四个独立实验的western blots密度测定法测定dCK蛋白水平。将这些值与从克隆试验中获得的SER绘制成三份曲线。F） 吉西他滨和dFdU治疗膀胱癌细胞系的细胞周期分析。将处于指数生长期的细胞与吉西他滨或dFdU孵育24小时，然后用碘化丙啶固定和染色。
图2
图2。吉西他滨对经siRNAs处理的RT112细胞对RRM1、hENT1、dCK和CDA的放射增敏作用。
A） 显示RT112细胞系中RRM1、hENT1、CDA和dCK的瞬时敲除的蛋白质印迹分析（n＝4）。使用50nM的siRNA和转染后24小时制备的裂解物实现敲除。B） 吉西他滨细胞毒性克隆原测定。在以每10厘米1000个细胞的速度重新播种之前，用增加剂量的吉西他滨处理先前用每个siRNA处理的次级流入细胞24小时2盘子。C） 使用非沉默控制（NSC）siRNA或RRM1 siRNA处理的细胞在有和无20 nM吉西他滨的情况下的克隆形成平板效率计算为含有≥50个细胞的菌落数除以接种的细胞数。该图显示了三个独立实验的平均电镀效率，误差条对应于平均值的标准误差（SEM）。D） HPLC分析未经处理的RT112与使用20 nM吉西他滨孵育24小时的RT112中的脱氧核苷酸三磷酸水平。数值计算为每10个dNTPs的平均细胞内浓度（pmoles）6来自两个独立实验的单元格，误差条对应于平均标准误差（SEM）。E） 按照图1C进行克隆分析。非沉默控制（NSC）siRNA的计算SER为1.3，RRM1 siRNA为1.39，CDA siRNA为1.25，hENT1 siRNA为1.3，dCK siRNA敲除细胞为1.07。
图3
图3。吉西他滨耐药膀胱癌细胞系中dCK的表达。
A） 用增加剂量的吉西他滨或dFdU处理CAL29和RT112细胞数代，直到对10μM药物产生耐药性（n=2）。B） 在mRNA水平定量PCR吉西他滨耐药细胞中的dCK表达（*表示P<0.001的显著性）。
图4
图4。在RTgem和CALgem膀胱癌细胞系中，dCK是吉西他滨敏感性所必需的。
A） 辐射克隆存活曲线。RTgem（左面板）、CALgem（中面板）、（耐10μM吉西他滨）和CALgem-外植体（右面板）细胞系在重新镀膜和照射前用20 nM吉西他滨处理24 h。B） Western blot检测CAL29、CALgem和CALgel外植体细胞系中dCK的表达，β微管蛋白作为等负荷的标记物（n=4）。C） 吉西他滨细胞毒性克隆形成试验。D） 按图1C处理的电池。在电镀后2周计数菌落。
图5
图5。吉西他滨和电离辐射后肿瘤生长延迟。
A） 携带皮下吉西他滨耐药CALgem异种移植物的小鼠被随机分配到肿瘤体积约为100 mm时的载体或治疗组（吉西他宾，连续5天2 Gy电离辐射（IR），或吉西他汀和5×2 Gy IR）三每1-3天测量一次肿瘤。当肿瘤体积达到400 mm时，处死小鼠三（*表示显著性<0.001）B）异种肿瘤血管的免疫组织化学分析。CALgem异种移植物（顶面板）中使用CD31（左面板）、dCK（中面板）和苏木精-伊红染色（右面板）对薄壁血管进行染色，人类T2期肌肉浸润性膀胱肿瘤中使用更大的血管进行染色（底面板）。C） CAL29细胞（顶面板）和CALgem（底面板）异种移植物的dCK（左面板和中面板）和苏木精和伊红（右面板）免疫组织化学分析。中间面板表示使用Aperio nuclear v9算法对细胞核进行的dCK免疫组化评分，该算法对相同肿瘤的三个独立染色复制品进行。
图6
图6。吉西他滨对小鼠成纤维细胞和人血管内皮细胞放射增敏。
A） 辐射克隆存活曲线。3T3细胞（左侧）在重新镀膜和照射前用20 nM吉西他滨处理24 h。HUVEC（右面板）在重新镀膜和照射前用1 nM和5 nM吉西他滨治疗24 h。B） Western blot检测3T3和HUVEC细胞系中dCK的表达，β肌动蛋白作为等负荷的标记物（n=2）。C） 共培养辐射克隆存活曲线。将3T3和CALgem细胞分别用20nM吉西他滨处理24小时，然后一起移植和照射。D） 共培养克隆存活。在用20 nM吉西他滨处理24 h之前，将3T3细胞作为单层培养。随后将CALgem细胞接种在3T3的细胞上并进行照射。
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