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.2014年10月；281(20):4557-67.
doi:10.1111/febs.13035。 Epub 2014年9月24日。

信号转导子和转录激活子3及磷脂酰肌醇3-激酶调节亚单位p55α和p50α调节体内自噬

萨拉·彭萨 1, 贝珊·劳埃德·刘易斯, 蒂莫西·萨格安特, Henrike K Resemann公司, C罗纳德·卡恩, 克里斯汀·沃森
附属公司

信号转导子和转录激活子3及磷脂酰肌醇3-激酶调节亚单位p55α和p50α调节体内自噬

萨拉·彭萨等。 FEBS J公司. 2014年10月.

摘要

乳腺退化涉及一个过程，其中包括成年哺乳动物机体细胞死亡的最引人注目的例子之一。我们之前已经表明，信号转导子和转录激活子3（Stat3）在退化的前48小时调节细胞死亡的溶酶体途径，并诱导乳腺上皮细胞中的溶酶体渗漏。有趣的是，Stat3还与伴随细胞死亡发生的自噬的显著诱导有关，可能是一种短暂的生存机制。磷脂酰肌醇3-激酶调节亚单位p55α和p50α在退化开始时被Stat3在转录水平上显著特异上调。我们在此表明，体内Stat3或p55α/p50α的消融会影响退化过程中的自噬。我们使用两种不同的细胞培养模型（正常乳腺上皮细胞和小鼠胚胎成纤维细胞）进一步研究p55α/p50α在自噬调节中的作用。我们的结果证明了p55α/p50α作为p85α介导的自噬抑制剂的直接作用。因此，Stat3及其下游靶点p55α/p50α是体内自噬和细胞死亡之间平衡的关键调节器。

关键词：PI3K；状态3；自噬；乳腺；p55α/p50α。

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数字

图1
图1
乳腺退化伴随着自噬的早期诱导，在缺乏Stat3的情况下，自噬被破坏。（A） 24小时退化时间点组织中乳腺上皮细胞的典型透射电子显微照片，显示双膜自噬小泡的证据（黑色箭头；标尺，500 nm）。（B） 通过透射电子显微镜观察细胞核上自噬血管（AVs）的定量。对每组3个独立的生物复制品进行了量化，以平均值±标准误差表示(**P（P）<0.01，通过单因素方差分析和事后Bonferroni校正确定）。（C） 定量实时PCR相对于亲环素a以下基因：Lc3a公司，微管相关蛋白1轻链3α；Lc3b公司微管相关蛋白1轻链3β；第62页，SQSTM1，固位体1；贝克林1。所有结果均为至少三个独立生物重复的平均值±标准偏差。10dL，哺乳10天；24hI，24小时复旧。(**P（P）<0.01，根据Student t检验确定）。（D） 如图所示，对对照小鼠泌乳（Lac）和退化（Inv）时间点的p62（红色）进行免疫组织化学分析。细胞核被Hoechst染色。比例尺，20μm。（E） 免疫印迹显示对照组和状态3−/−在对合过程中。dL，哺乳天数；hI，退化小时数。β-肌动蛋白是负载控制。β-肌动蛋白上LC3B II的定量如免疫印迹所示。（F） 定量实时PCR相对于亲环素a在24小时退化时显示的基因。所有结果均为至少四个独立生物重复的平均值±标准偏差(*P（P）<0.05，根据学生的t检验确定）。（G） 减少了中p62 punta的大小和数量状态3−/−腺体，p62免疫组化显示（红色）。细胞核被Hoechst染色。比例尺，20μm。
图2
图2
p55α/p50α缺失破坏乳腺的自噬。（A） 免疫印迹显示状态3−/−退化24h时腺体。β-肌动蛋白是负荷控制。五十、 泌乳；一、 内卷化。（B） 定量实时PCR相对于亲环蛋白a在24小时退化时显示的基因。所有结果均为至少五个独立生物重复的平均值±标准偏差(*P（P）<0.05，根据学生的t检验确定）。（C） 免疫印迹显示LC3B（LC3B II）的脂质化。车道代表独立的生物复制。Tubulin是装载控制装置。五十、 泌乳；一、 内卷化。Tubulin上LC3B II的定量如免疫印迹所示。（D） 减少了中p62 punta的大小和数量p55α−/−/p50α−/−腺体，p62免疫组化显示（红色）。细胞核被Hoechst染色。比例尺，20μm。
图3
图3
依赖OSM的p55α/p50α上调增加了自噬通量，同时增加了p62聚集物的数量。（A） 用载体或OSM刺激EpH4细胞达指定时间，并对指定蛋白进行免疫印迹，以显示OSM下游p55α/p50α的诱导。E-cadherin显示为加载控制。（B） OSM刺激的细胞中LC3B II增加。如图所示，用载体、OSM和/或bafilomycin Al处理EpH4细胞。然后通过免疫印迹分析LC3B的脂质化，显示了三个独立实验的一个时间过程。Tubulin是装载控制装置。（C） 免疫组化显示LC3B（红色）在用载体或OSM处理48小时的EpH4细胞中内源性表达。细胞核被Hoechst染色。比例尺，50μm。（D） p62蛋白水平在响应OSM时基本上没有变化。如图所示，用载体、OSM和/或bafilomycin Al处理EpH4细胞。用免疫印迹法分析p62，显示了三个独立实验中具有代表性的一个时间进程。Tubulin是装载控制装置。上图（B）和（D）是三个独立的生物复制品谱带强度的量化，以平均值±标准差表示(**P（P）<0.01，通过单向方差分析和事后Bonferroni校正确定）。（E） 用载体或OSM刺激EpH4细胞48h和/或bafilomycin Al对p62（红色）进行免疫组织化学染色，结果显示，OSM刺激后，p62点状物的积累增加，Bafiloymcin A1处理后p62点的积累增加。比例尺，50μm。
图4
图4
p55α/p50α抑制原发性MEF中的自噬。（A，B）来源于对照（+/+）和p55α−/−/p50α−/−小鼠（−/−）（A）或pik3r1型+/+和pik3r1型−/−如图所示，3T3 MEF（B）用巴菲尔霉素铝预处理2h，然后用EBSS培养基在巴菲尔菌素铝存在下饥饿2h。然后通过免疫印迹分析LC3B的脂质化。磷酸化p70 S6K的免疫印迹显示饥饿时mTOR的有效抑制。Tubulin是装载控制装置。Tubulin上LC3B II的定量如免疫印迹所示。（C） 乳腺退化过程中自噬与LM-PCD相互作用的图形总结，强调Stat3和p55α/p50α亚基的作用。我们的数据表明，自噬提供了一个短暂的生存信号，该信号被Stat3诱导的p55α/p50α表达所覆盖。同时，溶酶体组织蛋白酶（cts）的诱导和溶酶体渗漏通过阻止其溶解进一步抑制自噬。
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