Conditional expression of Parkinson's disease-related R1441C LRRK2 in midbrain dopaminergic neurons of mice causes nuclear abnormalities without neurodegeneration

doi:10.1016/j.nbd.2014.08.027

.2014年11月：71:345-58。

doi:10.1016/j.nbd.2014.08.027。 Epub 2014年8月29日。

帕金森病相关R1441C LRRK2在小鼠中脑多巴胺能神经元中的条件性表达导致核异常而无神经变性

附属公司

¹瑞士洛桑1015号洛桑联邦理工学院生命科学学院大脑思维研究所（EPFL）。
²美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所神经再生和干细胞项目，邮编21205；约翰霍普金斯大学医学院神经病学系，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21205。
^三瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡研究所神经科学系。
⁴瑞士洛桑1015，洛桑理工学院（EPFL）跨学科电子显微镜中心。
⁵美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所神经再生和干细胞项目，邮编21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经病学系，邮编：21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生理学系，邮编：21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系，邮编21205；阿德里安·赫利斯·马尔文医学研究基金会，美国洛杉矶70130-2685新奥尔良。
⁶瑞士洛桑1015号洛桑理工学院生命科学学院大脑心智研究所；美国密歇根州49503 Grand Rapids Van Andel研究所神经变性科学中心。电子地址：Darren.Moore@vai.org。

PMID： 25174890
预防性维修识别码： PMC4455551型
内政部： 2016年10月10日/j.nbd.2014.08.027

帕金森病相关R1441C LRRK2在小鼠中脑多巴胺能神经元中的条件性表达导致核异常而无神经变性

埃尔皮达·齐卡等。神经生物学疾病. 2014年11月.

.2014年11月：71:345-58。

doi:10.1016/j.nbd.2014.08.027。 Epub 2014年8月29日。

附属公司

¹瑞士洛桑1015号洛桑联邦理工学院生命科学学院大脑思维研究所（EPFL）。
²美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所神经再生和干细胞项目，邮编21205；约翰霍普金斯大学医学院神经病学系，美国马里兰州巴尔的摩，邮编21205。
^三瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡研究所神经科学系。
⁴瑞士洛桑1015，洛桑理工学院（EPFL）跨学科电子显微镜中心。
⁵美国马里兰州巴尔的摩市约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所神经再生和干细胞项目21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经病学系，邮编：21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学系，邮编：21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生理学系，邮编：21205；美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院药理学和分子科学系，邮编21205；阿德里安·赫利斯·马尔文医学研究基金会，美国洛杉矶70130-2685新奥尔良。
⁶瑞士洛桑大学生命科学学院大脑思维研究所（EPFL），1015洛桑；美国密歇根州49503 Grand Rapids Van Andel研究所神经变性科学中心。电子地址：Darren.Moore@vai.org。

PMID： 25174890
预防性维修识别码： PMC4455551型
内政部： 2016年10月10日/j.nbd.2014.08.027

摘要

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）基因突变可导致晚发型常染色体显性帕金森病（PD）。LRRK2-连锁PD的临床和神经化学特征与特发性疾病相似，尽管神经病理学有点异质性。LRRK2的显性突变通过毒性获得功能机制导致神经退化，这种机制可以在过度表达人类LRRK_2变体的转基因小鼠中建模。许多LRRK2转基因小鼠模型已经开发出来，显示多巴胺能神经传递异常和τ代谢改变，但没有持续诱导多巴胺能神经元变性。为了直接探讨突变LRRK2对黑质纹状体多巴胺能通路的影响，我们开发了条件转基因小鼠，该小鼠从内源性小鼠ROSA26启动子在多巴胺能神经元中选择性表达人R1441C LRRK2。在20岁以下的小鼠中，R1441C LRRK2的表达不会导致黑质多巴胺能神经元变性或纹状体多巴胺缺陷，也不会沉淀含有α-同核蛋白、τ、泛素或自噬标记物（LC3和p62）的异常蛋白内含物。此外，随着年龄的增长，表达R1441C LRRK2的小鼠表现出正常的运动活动和嗅觉功能。有趣的是，R1441C LRRK2的表达诱导了黑质多巴胺能神经元核膜的年龄依赖性异常，包括核循环减少和核膜内陷增加。此外，R1441C LRRK2小鼠培养的中脑多巴胺能神经元的轴突复杂性增加。总之，这些新的R1441C-LRRK2条件转基因小鼠揭示了随着年龄的增长多巴胺能神经元形态的改变，并为探索PD中R1441C-LRRK2突变的致病机制提供了有用的工具。

关键词：多巴胺能；LRRK2；神经变性；核膜；公园8；帕金森病；转基因。

PubMed免责声明

数字

**图1。条件R1441C LRRK2转基因小鼠的制备**
(A类)生成R26-LRRK2转基因小鼠的基因靶向策略示意图。具有R1441C突变的全长人LRRK2 cDNA位于牛多腺苷酸化信号（bpA）的上游和SV40剪接受体（SA）的下游，新霉素抗性基因侧翼为液氧P位点（PGK-neo）和三重转录终止序列（tpA）。整个磁带通过*太平洋岛屿倡议*和*AscI公司*限制站点。将pROSA26PA-LRRK2构建物线性化并电穿孔到ES细胞中，在同源重组后，将含有LRRK2的盒插入内源性ROSA26启动子下游的ROSA26位点。Cre介导的neo-tpA终止盒切除仅在Cre阳性神经元中导致由内源性ROSA26启动子驱动的LRRK2转基因表达。指出了用于基因分型的PCR引物（箭头）和用于Southern blot分析的探针的位置。(B类)Southern印迹分析*EcoRV消化*从ES细胞克隆中分离出基因组DNA。这个³²P-标记DNA探针在ROSA26基因组位点杂交，如(A类)检测到野生型等位基因为11kb，转基因靶向等位基因3.8kb。显示了两种不同的ES细胞系（K和T）和选择用于胚泡显微注射的克隆（*）。(C类)在不同引物引物的独立反应中，对R26-LRRK2/DAT-Cre小鼠进行PCR基因分型，以区分目标转基因等位基因（～300 bp）和野生型等位基因，以及DAT-Cre转基因基因（～400 bp）和非转基因（无产物）。(D类)反转录从不同脑区提取的总mRNA：嗅球（OB）、额叶皮层（Ctx）、纹状体（Str）、海马（Hip）、腹侧中脑（VM）、小脑（Crb）和脊髓（SC），然后使用iCre、小鼠TH和GAPDH特异引物进行PCR。(E类)对具有抗LRRK2抗体（c81-8/MJFF4和N241A/34）的相同脑区提取物进行Western blot分析。使用酪氨酸羟化酶（TH）和β-微管蛋白抗体作为对照，分别用于i）分离含有多巴胺能神经元的脑区和ii）等量蛋白负载。分子质量标记以千道尔顿表示。(F类)用NIH ImageJ软件对归一化为β-微管蛋白水平的不同脑区的LRRK2水平（c81-8/MJFF4抗体）进行密度分析。条形代表平均值±SEM(n个=3只动物/基因型）。通过未配对的双尾Student’st吨-测试*P（P）*-显示值。

**图2。条件R1441C LRRK2转基因小鼠行为学分析**
(A类)在20个月时测量雄性和雌性转基因小鼠的体重(n个=6只小鼠/基因型）。(B类)在转基因小鼠20个月大时，通过气味检测试验评估嗅觉功能，记录检索隐藏食物刺激的潜伏期(n个=6只小鼠/基因型）。(C类)转基因小鼠的运动协调和平衡通过其在6个月龄（开放圈）和19个月龄时（封闭圈）在旋转木马上的表现进行评估。使用加速旋转范式（5分钟内5至50 rpm）连续4天进行测试。记录小鼠从旋转杆上跌落的潜伏期(n个=6只动物/基因型）。(**D-E公司**)对10个月龄（开放矩形）和20个月龄的转基因小鼠（封闭矩形）在开放区域进行测试，以评估它们在新环境中的运动活动和焦虑行为。机车活动是通过20分钟内在开阔场地上行驶的总距离以及进入竞技场后每5分钟的距离和速度来测量的(n个=6只动物/基因型）(D类). 记录在露天竞技场中心区的时间作为焦虑指数(E类). (**F-H（飞行高度）**)采用自动步态分析方法对11个月龄和20个月龄转基因小鼠进行步态分析。计算出的时间参数是每只动物穿过走道的时间(F类)步行速度（以每秒钟跑完的距离计算）、步行速度的变化以及反映试验期间步频的步频(**G公司**). (**H（H）**)通过计算支撑底座（行走时前爪或后爪之间的距离）和打印位置（后爪和之前放置的同侧前爪之间的间距）来评估爪子之间的相对空间关系。小鼠穿过走道时采用的步长顺序模式反映了腿间的协调(n个=6只动物/基因型）。所有图表上的数据均表示平均值±SEM。各组之间每个时间点的比较由未配对的双尾学生的t吨-测试ns，无显著性。

**图3。转基因小鼠黑质纹状体多巴胺能通路的特征**
(A类)R26-LRRK2黑质TH免疫染色的代表性图像^+/+和R26-LRRK2^+/+/DAT-Cre小鼠12个月和22个月龄。比例尺：100μm。(B类)转基因小鼠22个月时腹侧中脑TH染色的代表性低倍显微照片。比例尺：500μm。(C类)R26-LRRK2治疗12个月和22个月时黑质多巴胺能（TH阳性或VMAT阳性）和尼塞尔阳性神经元的体视学定量^+/+和R26-LRRK2^+/+/DAT-核心小鼠。条形代表平均值±SEM（n）=5只动物/基因型）。差异由未配对的双尾学生的t吨-试验，ns，无显著性。(D类)R26-LRRK2纹状体神经末梢TH免疫染色的代表性显微照片^+/+和R26-LRRK2^+/+/DAT-Cre小鼠12个月和22个月龄。比例尺：500μm。(E类)纹状体TH免疫染色定量。数据表示所分析组织每一区域TH阳性信号（代表多巴胺能纤维）的光密度。条形代表平均值±SEM(n个≥4只动物/基因型）。各组在每个时间点的差异由未配对的双尾学生的t吨-试验，ns，无显著性。(F类)通过HPLC和电化学检测对10个月大的纯合R26-LRRK2的纹状体儿茶酚胺水平进行评估^+/+和R26-LRRK2^+/+/DAT-核心小鼠。每种生物胺的浓度以微克蛋白质表示。显示了多巴胺及其代谢物的水平：3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）、3-甲氧基吡喃胺（3-MT）和多巴胺周转率（[DOPAC+HVA]/DA）。还评估了5-羟色胺（5-HT）及其代谢物5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）的浓度。条形代表平均值±SEM（n=5动物/基因型）。(**G公司**)21-24个月大杂合子R26-LRRK2的纹状体儿茶酚胺水平测定^+/-和R26-LRRK2^+/-/DAT-核心小鼠(n个=5只动物/基因型）。各年龄组之间的比较由未配对、双尾学生的t吨-试验，ns，无显著性。

**图4。R1441C LRRK2转基因小鼠的多巴胺能神经元表现出增加的轴突复杂性**
(A类)R26-LRRK2腹侧中脑的原代培养^+/+/DAT-Cre和R26-LRRK2^+/+同窝雌鼠控制P1，固定在DIV 7上，用MAP2和TH抗体进行免疫染色，以标记多巴胺能神经元。每种情况都显示了具有代表性的荧光显微图像。ICA假彩色用于识别多巴胺能神经元胞体（箭头）和神经突起以进行追踪。比例尺：500μm。(B类)在来自每个基因型至少四只小鼠的独立中脑培养物中，定量TH阳性多巴胺能神经元的轴突和树突状突起长度。条形代表神经突长度（平均值±SEM，n个=80个神经元/基因型）。(C类)对DIV 7的TH阳性多巴胺能神经炎进行Sholl分析，以评估以每个神经元胞体为中心的具有半径增加的同心圆（μm）的树突交叉点的平均数量。条形代表平均值±SEM(n个=80个神经元/基因型）。(D类)Sholl回归系数（k值）用于描述树突状树枝状结构随与神经元胞体距离的增加而发生的变化。该值来自以下函数：log10（N/S）=-k×r+m，其中N是面积S和半径r的圆的枝晶交点数。此方程得出的回归线的斜率k随着距胞体距离的增加，枝晶密度的变化越大而减小。对每个基因型至少四只小鼠的独立培养物进行测量。数据表示平均值±SEM（n）=80个神经元/基因型）。两种基因型之间的比较是通过未配对的双尾Student’s进行的t吨-测试(**P（P）*<0.01或***P（P）*<0.0001). ns，无显著性。

**图5。条件R1441C LRRK2转基因小鼠的神经病理学分析**
R26-LRRK2黑质致密部免疫组织化学分析的代表性显微照片^+/+/DAT Cre和R26-LRRK2^+/+22个月大的老鼠。切片用Gallyas银染或检测泛素的抗体、自噬体标记物LC3、自噬底物p62/固存体、星形细胞标记物GFAP、在Ser202磷酸化的tau（克隆CP13）、tau病理形态（克隆MC1）、在Ser396/Ser404磷酸化的tau（克隆PHF-1）、总α-突触核蛋白、，α-synuclein在Ser129磷酸化（P-α-synuglein）。插图显示放大倍数较高的图像。比例尺：50μm。

**图6。老年R1441C LRRK2转基因小鼠的核形态异常**
(A类)20-22个月龄R26-LRRK2腹侧中脑组织的透射电镜分析^+/+/DAT-Cre和R26-LRRK2^+/+老鼠。每个小鼠基因型的神经元代表性图像显示了细胞核（N）和核仁（Nu）。用于量化的核痕迹示例以黄色突出显示。比例尺：2μm。(B类)核面积定量（μm²)、核周长（μm）、每个核的平均内陷数和圆度指数。数据表示平均值±SEM（n≥10个神经元/动物），从至少2只动物/基因型中取样。(C类)用TH和层粘连蛋白B1抗体共同标记22个月时转基因小鼠黑质的免疫荧光分析，以确定多巴胺能神经元的核形态。插图表示合并图像中方框区域的放大。比例尺：15μm。(D类)用0（不规则形状）到1（完美圆形）的圆度指数评估核膜的形态。核圆度的频率分布(左边)和面积(*正确的*)每个图中都显示了多巴胺能神经元。数据表示平均值±SEM(n个=220，R26-LRRK2^+/+，或n个=158，R26-LRRK2^+/+/DAT-Cre，神经元）从4只小鼠/基因型中取样。统计分析由未配对的双尾学生t吨-测试(**P（P）*<0.05或***P（P）*<0.001). ns，无显著性。

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1. Lang AE，Lozano AM。帕金森病。两部分的第一部分。新英格兰医学杂志。1998;339:1044–1053.-公共医学
1. Lang AE，Lozano AM。帕金森病。第二部分，共两部分。新英格兰医学杂志。1998;339:1130–1143.-公共医学
1. Spillantini MG、Schmidt ML、Lee VM、Trojanowski JQ、Jakes R、Goedert M.路易体内的α-突触核蛋白。自然。1997;388:839–840.-公共医学
1. Gasser T.孟德尔形式的帕金森氏病。生物化学与生物物理学报。2009;7:587–596.-公共医学
1. Healy DG、Falchi M、O'Sullivan SS、Bonifati V、Durr A、Bressman S、Brice A、Aasly J、Zabetian CP、Goldwurm S等。LRRK2-相关帕金森病的表型、基因型和全球遗传外显率：一项病例对照研究。柳叶刀神经学。2008;7:583–590.-项目管理咨询公司-公共医学

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[3] Lang AE，Lozano AM。帕金森病。第二部分，共两部分。新英格兰医学杂志。1998;339:1130–1143.-公共医学

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[6] Spillantini MG、Schmidt ML、Lee VM、Trojanowski JQ、Jakes R、Goedert M.路易体内的α-突触核蛋白。自然。1997;388:839–840.-公共医学

[7] Gasser T.孟德尔形式的帕金森氏病。生物化学与生物物理学报。2009;7:587–596.-公共医学

[8] Gasser T.孟德尔形式的帕金森氏病。生物化学与生物物理学报。2009;7:587–596.-公共医学

[9] Healy DG、Falchi M、O'Sullivan SS、Bonifati V、Durr A、Bressman S、Brice A、Aasly J、Zabetian CP、Goldwurm S等。LRRK2-相关帕金森病的表型、基因型和全球遗传外显率：一项病例对照研究。柳叶刀神经学。2008;7:583–590.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Healy DG、Falchi M、O'Sullivan SS、Bonifati V、Durr A、Bressman S、Brice A、Aasly J、Zabetian CP、Goldwurm S等。LRRK2-相关帕金森病的表型、基因型和全球遗传外显率：一项病例对照研究。柳叶刀神经学。2008;7:583–590.-项目管理咨询公司-公共医学

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