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.2014年8月27日;9(8):e105568。
doi:10.1371/journal.pone.0105568。 2014年电子收集。

Jak2小分子抑制剂G6在体内外降低T98G胶质母细胞瘤细胞的致瘤潜能

附属公司

Jak2小分子抑制剂G6在体外和体内降低T98G胶质母细胞瘤细胞的致瘤潜力

丽贝卡·巴斯金等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见、最具侵袭性的原发性脑肿瘤。Jak2是一种非受体酪氨酸激酶,通过与各种细胞表面受体的结合参与增殖信号传导。高活性Jak2信号转导与许多血液系统疾病以及包括GBM在内的各种实体肿瘤有关。我们的实验室开发了一种Jak2小分子抑制剂,称为G6。它在Jak2介导的血液病的体外和体内模型中显示出强大的功效。在这里,我们假设G6会抑制表达过度活跃Jak2的GBM细胞的致病性生长。为了验证这一点,我们筛选了几种GBM细胞系,发现T98G细胞表达易于检测的活性Jak2水平。我们发现G6处理这些细胞以剂量依赖的方式降低了Jak2和STAT3的磷酸化。此外,G6治疗降低了这些细胞的迁移潜能、侵袭潜能、克隆生长潜能和整体生存能力。G6的作用是由于其直接抑制Jak2功能,而不是通过非靶向激酶,因为这些作用在接受Jak2特异性shRNA的T98G细胞中得到了重现。与使用载体对照的细胞相比,G6还显著增加了T98G的caspase依赖性凋亡水平。最后,当将T98G细胞注射到裸鼠体内时,G6治疗显著降低了肿瘤体积,这与肿瘤内磷酸化Jak2和磷酸化STAT3的水平显著降低相伴随。此外,与来自接受载体对照溶液的小鼠的肿瘤相比,从接受G6的小鼠收获的肿瘤具有显著更低的波形蛋白水平。总的来说,这些体外和体内的联合结果表明,G6可能是一种可行的治疗方案,可以对抗Jak2过度激活的GBM。

PubMed免责声明

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竞争利益:提交人声明,不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。G6降低T98G细胞中的Jak2和STAT3磷酸化。
A) 磷酸化Jak2在三种胶质母细胞瘤细胞系中的表达。γ2A+Jak2细胞裂解物用作Jak2阳性对照。所示为三个代表性斑点之一。B) 用指示浓度的G6处理T98G细胞24小时,并通过Western blot检测Jak2和STAT3磷酸化水平。所示为每种蛋白质的三个代表性斑点之一。Jak2(C)和STAT3(D)磷酸化水平的量化(n = 各3个)。*,ANOVA测定,与DMSO对照处理细胞相比,p<0.05。
图2
图2。G6处理降低了T98G细胞的活性和克隆生长潜能。
A) 用增加浓度的G6处理T98G细胞72小时,并用MTS测定细胞活力。每个点测量三次。所示为三个代表性结果之一。方差分析表明,与仅用二甲基亚砜处理的细胞相比,10µM和30µM条件下的细胞显著降低(p<0.05)。B) 用G6处理T98G细胞达到指定的时间和浓度。然后通过MTS测量细胞活力。每个点测量三次。所示为三个代表性结果之一。**,ANOVA测定,相对于DMSO处理的细胞,p<0.01。C) 将T98G细胞在指定浓度下用G6处理24小时,清洗并接种在100 mm培养皿中。细胞再生长九天,用结晶紫染色,然后计数菌落。所示为四个代表性结果的平均值。*,ANOVA测定,相对于DMSO处理的细胞,p<0.05。
图3
图3。G6降低T98G细胞的迁移和侵袭潜能。
A) 在所示浓度下用G6处理细胞24小时,清洗并划伤。24小时和48小时后监测细胞迁移。所示为三个代表性结果之一。B) 用G6以指定浓度处理细胞24小时,洗涤,并在未涂布的24孔插入物中铺板。24小时后用结晶紫染色观察细胞迁移。所示为三个代表性结果之一。C) 在指定浓度下用G6处理细胞24小时,并将其置于涂有基质的24孔插入物中。48小时后用结晶紫染色检测细胞浸润。显示的是三个具有代表性的结果之一。D) 量化(n = 3) 迁移细胞的数量。*,ANOVA测定,与DMSO对照处理细胞相比,p<0.05。E) 量化(n = 3) 入侵细胞。比例尺表示100µm(A)或50µm,ANOVA测定,与DMSO对照处理细胞相比,p<0.05。
图4
图4。Jak2敲除降低T98G细胞的迁移和侵袭潜能。
A) 用qRT-PCR检测Jak2 mRNA的表达。每个样品测量三次。所示为三个代表性结果之一。B) Western blot检测Jak2蛋白表达。C) 从三个独立的印迹定量Jak2蛋白表达。D) 细胞被放置在24孔插入物中,24小时后监测其迁移。E) 四个独立实验中迁移细胞的量化。F) 细胞被镀在涂有基质的24孔插入物中,48小时后监测其侵袭情况。G) 四个独立实验中入侵细胞的定量。比例尺表示50微米(D和10X F)或100微米(4X F)*,与Student’s确定的加扰shRNA相比p<0.05t吨测试。
图5
图5。G6诱导T98G细胞caspase依赖性凋亡。
A) G6处理细胞48小时,TUNEL免疫荧光检测细胞凋亡。所示为三个独立结果之一。比例尺 = 50微米。B) 量化(n = 3) TUNEL阳性细胞百分比*,ANOVA测定,与DMSO对照处理细胞相比,p<0.05。C) 用10µM浓度的G6处理细胞达到指定时间,并在指定时间通过发光分析测定Caspase 3/7活性。每个点测量一式三份,显示为三个独立实验中的一个。方差分析确定的72小时时间点之间存在显著差异(*,p<0.05)。D) 用G6处理细胞48小时,用Western blot检测全长Caspase-3的表达。所示为两个代表性斑点之一。
图6
图6。G6降低了T98G异种移植物的肿瘤体积,这与BIM和BAX表达增加一致。
A) 肿瘤形成后,小鼠开始每天注射二甲基亚砜(n = 4) 或10 mg/kg G6(n = 5) 第0天。肿瘤体积绘制为治疗条件和时间的函数。B) 肿瘤中各种凋亡标记物的平均mRNA水平。*,p<0.05,**,p<0.01。
图7
图7。肿瘤体积减少与磷酸化Jak2和磷酸化STAT3水平降低相关。
图6所示为固定、切片和染色后来自相同九只小鼠的代表性肿瘤切片。H&E染色切片中,有丝分裂细胞用绿色箭头表示。对于pJak2、pSTAT3、Ki-67和三色,通过相对像素计数量化染色的相对强度。然后将平均像素数绘制为功能治疗组。物镜放大倍数为50X(H&E)或40X(pJak2、pSTAT3、Ki-67和Trichrome)。比例尺 = 50微米*,p<0.05,**,p<0.01。
图8
图8。G6降低T98G衍生肿瘤中的波形蛋白水平。
A) 通过Western blot测定图6所示的相同九个肿瘤样本中波形蛋白水平的表达。图中还显示了作为负荷控制的β-肌动蛋白水平。B) 量化归一化为β-肌动蛋白的波形蛋白水平。C) 典型的抗波形蛋白免疫化学图像显示G6治疗肿瘤中波形蛋白表达降低。比例尺表示50µm(顶部面板)或10µm。D) 通过相对像素计数对波形蛋白染色的强度进行量化,然后将平均像素计数绘制为函数处理组。E) 肿瘤切片进行抗波形蛋白免疫荧光(红色),通过DAPI染色(蓝色)显示细胞核。作为对G6的反应,剩余的波形蛋白形成了一些不规则的核周聚集物。比例尺代表20µm(大面板)或5µm,*,p<0.05,**,p<0.01。

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引用人

工具书类

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