The Aurora-A inhibitor MLN8237 affects multiple mitotic processes and induces dose-dependent mitotic abnormalities and aneuploidy

doi:10.18632/oncotarget.2190

.2014年8月15日；5(15):6229-42.

doi:10.18632/noctarget.2190。

Aurora-A抑制剂MLN8237影响多个有丝分裂过程并诱导剂量依赖性有丝分裂异常和非整倍体

意大利Anna Asteriti¹, 埃里卡·迪·塞萨尔¹, Fabiola De Mattia公司¹, 沃尔克·希尔森斯坦², 比特·诺依曼², 恩里科·坎达里¹, 帕特里齐亚·拉维亚¹, 朱利娅·瓜格利尼¹

附属公司

¹意大利罗马萨皮恩扎大学国家研究委员会生物、分子医学和纳米生物技术研究所（前分子生物学和病理学研究所）。
²德国海德堡Meyerhofstraße 1 EMBL高级光学显微镜设备。

PMID： 25153724
预防性维修识别码： PMC4171625型
内政部： 10.18632/目标2190

Aurora-A抑制剂MLN8237影响多个有丝分裂过程并诱导剂量依赖性有丝分裂异常和非整倍体

意大利Anna Asteriti等。 Oncotarget公司. 2014.

.2014年8月15日；5(15):6229-42.

doi:10.18632/noctarget.2190。

作者

意大利Anna Asteriti¹, 埃里卡·迪·塞萨尔¹, Fabiola De Mattia公司¹, 沃尔克·希尔森斯坦², 比特·诺依曼², 恩里科·坎达里¹, 帕特里齐亚·拉维亚¹, 朱利亚·瓜瓜格里尼¹

附属公司

¹意大利罗马萨皮恩扎大学国家研究委员会生物、分子医学和纳米生物技术研究所（前分子生物学和病理学研究所）。
²高级光学显微镜设备，EMBL，Meyerhofstraße 1，德国海德堡。

PMID： 25153724
预防性维修识别码：下午171625
内政部： 10.18632/目标2190

摘要

小分子抑制Aurora激酶活性作为一种潜在的抗癌策略正在积极研究中。Aurora抑制剂的成功治疗应用依赖于对灭活Aurora激酶对细胞分裂的影响的全面理解，鉴于这些激酶在有丝分裂期间的多效性作用，这是一个具有挑战性的目标。在这里，我们使用Aurora-A抑制剂MLN8237在U2OS人类癌细胞同步进行有丝分裂的剂量反应分析中进行，目前正在进行第一/三期临床试验。通过活显微镜观察单个Aurora抑制细胞在有丝分裂中的行为和命运，我们发现MLN8237处理影响对Aurora-A功能丧失不同敏感的多个过程。Aurora-A在控制细胞分裂方向中的作用显现出来。MLN8237即使是高剂量治疗，也无法有效消除分裂细胞或其子代，同时在子代细胞中诱导显著的非整倍体。单细胞分析的结果表明，MLN8237对细胞有复杂的反应，并有证据表明其作用具有强烈的剂量依赖性：这些问题值得考虑，以设计通过抑制极光激酶杀死癌细胞的策略。

PubMed免责声明

数字

**图1。MLN8237对Aurora-A和Aurora-B的剂量依赖性抑制**
A.胸腺嘧啶核苷（Thym）阻滞和释放后细胞向有丝分裂方向发展的MLN8237治疗方案。B.控制组（DMSO）或MLN8237处理的前中期的活性pThr288-Aurora-A（左，极点平均强度）或活性pThr 232-Aurora-B（右，染色体总强度）的中频信号量化如方框图所示（中心线表示中位数；方框极限表示R软件确定的第25和75个百分位；胡须从第25和75百分位延伸到四分位范围的1.5倍，异常值用点表示）。荧光强度以任意单位（a.u.）表示。**：p<0.0001，未配对t检验或Mann-Whitney检验。n=来自3个实验的90个纺锤极（p-Aurora-A）或50个前中期（p-Aurra-B）。显示了具有代表性的IF图像。比例尺：10μm。与经二甲基亚砜或诺卡唑（NOC）处理的U2OS培养物（4小时）相比，经MLN8237处理（收获前1或4小时）的有丝分裂提取物中的C.p-Aurora-A（活性）水平降低。还显示了Aurora-A总水平；肌动蛋白用作加载控制。由于缺乏适用于该应用的合适抗体，在Western blot中未对p-Aurora-B进行评估。

**图2。MLN8237延迟进入有丝分裂**
A.来自对照组（DMSO）和MLN8237处理培养物的有丝分裂指数（MI）（方案如图1A所示），通过DAPI（DNA）和α-管蛋白（纺锤体）染色进行评估。显示了与对照培养物、计分细胞数（n）和独立实验数（exp）相关的p值（χ2检验）。B.对照组（DMSO）和MLN8237处理的培养物在治疗开始后的16小时内通过延时成像进行记录。该图显示了记录期间进入有丝分裂的间期的百分比；结果以4小时为一组。在每种条件下的3个实验中记录了250个间期。

**图3。MLN8237处理的培养物中有丝分裂的剂量依赖性延长**
顶部描述了MLN8237处理的培养物从胸腺嘧啶（Thym）阻滞和释放向有丝分裂方向发展的延时记录协议。每隔30分钟用10倍物镜采集一次相控显微镜图像。有丝分裂的持续时间是从取整到两个不同子细胞的可视化计算得出的；每个条代表一个有丝分裂细胞。从3个实验中显示每个条件至少90个细胞。

**图4。MLN8237处理的有丝分裂中的纺锤体缺陷**
MLN8237处理（方案如图1A所示）4小时后收获的培养物进行DNA和α-管蛋白染色。直方图表示显示正常或有缺陷心轴的前中期百分比（顶部的IF面板）。每种条件下从3个实验中计数250-300个细胞；s.d.如图所示。比例尺：10μm。

**图5。MLN8237处理的有丝分裂的时程分析揭示了多极和“无分裂”表型**
按照图3中的方案处理的培养物从治疗开始后的24小时通过延时记录。每隔5分钟用40倍物镜采集DIC图像；显示了具有代表性的单张照片；显示从舍入到上的时间。第一排：有丝分裂正常；第二排和第三排：多极有丝分裂（a、b和c表示子细胞）；第四行和第五行：有丝分裂直接从前中期进入缺陷间期，有（下）或无（上）一个“起泡”期。缺陷数量（%）如下表所示；记录的有丝分裂数目（n）和每种条件下的独立实验。*：0.01

**图6。Aurora-A抑制诱导错误定向细胞分裂**
A.顶部显示了一个正常划分单元的示例。在具有荧光标记的H2B（绿色）和α-微管蛋白（红色）的U2OS细胞中，MLN8237存在下的定向错误分裂如下所示。显示取整后的会议记录。比例尺：10μm。B.MLN8237治疗开始后20小时内记录的错误定向细胞分裂的定量（%）（3-4个独立实验中每种情况80-200次有丝分裂）。*：0.012测试。C.MLN8237处理的有丝分裂中，生长表面与中心体-中心体轴之间的夹角按顶部示意图计算（中心体为红色，详见方法）；直方图表示原丝蛋白酶在3个类别中的分布（来自3个独立实验的50-60个细胞）。

**图7。MLN8237抑制剂治疗有丝分裂的结果**
A.用于分析MLN8237处理的有丝分裂的子代的方案的示意图。B.IF面板显示不同的得分类别。DNA、MT、核膜和中心体的标记和色码显示在左侧。在上面的面板中，DAPI通道中的插图显示微核增大，而合并图像中的插图则显示中心体增大。比例尺：10μm。C.直方图表示B中缺陷的发生率（%）。在3个实验中，每个条件下至少有1000个细胞；s.d.如图所示。

**图8。MLN8237处理细胞的倍性改变**
A.CREST阳性（左面板）或阴性（右面板）微核的IF图像。插图显示微核增大。直方图表示MLN8237处理培养物中CREST阳性或阴性微核的间期（与对照组相比增加了一倍）。从4个实验中计算出每种条件下400个细胞。s.d.如图所示。比例尺：10μm。B.第7和11号染色体具有不同数量信号的间期分布（FISH杂交）。在2个实验中，每种条件下计数800-1000个细胞。

**图9。MLN8237处理培养物的长期高通量分析**
按图3处理的培养物记录48小时。使用CellCognition软件对图像进行自动分割和分类。A.为训练分类器而定义的类显示了每个类的代表性示例。B.左边的直方图表示从采集的第一帧到最后一帧活细胞数量的增加。显示了3个独立实验中10个重复的平均值和标准差。在时间0处分析的样品大小为每个重复至少500个细胞。右侧的直方图表示仅在相同条件下正常界面的增加。C.折线图表示录制期间每个类的单元格百分比。

**图10。MLN8237对细胞生长和活性的剂量依赖性影响**
A.在MLN8237治疗开始48和96小时后对细胞进行计数。值表示相对于t=0h的细胞数量增加（3个独立实验）。B.通过FACS分析检测到的MLN8237处理培养物中的亚G1细胞百分比如直方图所示（3个实验）。s.d.显示。

**图11。MLN8237对细胞分裂和非整倍体诱导的剂量依赖性作用：概述**
U2OS细胞中沿着MLN8237浓度梯度的表型分布示意图（Up：有丝分裂缺陷。Low：异常子细胞间期）。极光-A（蓝色）和极光-B（橙色）的逐渐抑制由形状内的梯度指示（剂量间隔不按比例）；请注意，在20 nM MLN8237下，Aurora-A抑制几乎完全。

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1. Marumoto T、Honda S、Hara T、Nitta M、Hirota T、Kohmura E、Saya H.Aurora-A激酶维持HeLa细胞早期和晚期有丝分裂事件的保真度。生物化学杂志。2003;278:51786–51795.-公共医学
1. Katayama H、Sasai K、Kloc M、Brinkley BR、Sen S.Aurora激酶-A调节人类细胞中与动粒/染色质相关的微管组装。细胞周期。2008;7:2691–2704.-公共医学
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[1] Hirota T、Kunitoku N、Sasayama T、Marumoto T、Zhang D、Nitta M Hatakeyama K、Saya H.Aurora-A和一种相互作用的激活剂LIM蛋白Ajuba是人类细胞有丝分裂所必需的。单元格。2003;114:585–598。-公共医学

[2] Hirota T、Kunitoku N、Sasayama T、Marumoto T、Zhang D、Nitta M Hatakeyama K、Saya H.Aurora-A和一种相互作用的激活剂LIM蛋白Ajuba是人类细胞有丝分裂所必需的。单元格。2003;114:585–598。-公共医学

[3] Marumoto T、Honda S、Hara T、Nitta M、Hirota T、Kohmura E、Saya H.Aurora-A激酶维持HeLa细胞早期和晚期有丝分裂事件的保真度。生物化学杂志。2003;278:51786–51795.-公共医学

[4] Marumoto T、Honda S、Hara T、Nitta M、Hirota T、Kohmura E、Saya H.Aurora-A激酶维持HeLa细胞早期和晚期有丝分裂事件的保真度。生物化学杂志。2003;278:51786–51795.-公共医学

[5] Katayama H、Sasai K、Kloc M、Brinkley BR、Sen S.Aurora激酶-A调节人类细胞中与动粒/染色质相关的微管组装。细胞周期。2008;7:2691–2704.-公共医学

[6] Katayama H、Sasai K、Kloc M、Brinkley BR、Sen S.Aurora激酶-A调节人类细胞中与动粒/染色质相关的微管组装。细胞周期。2008;7:2691–2704.-公共医学

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[8] De Luca M，Lavia P，Guargaglini G.Aurora-A、Plk1和TPX2在纺锤体极点的功能相互作用：Plk1控制Aurora-A和TPX2纺锤体关联的中心体定位。细胞周期。2006年；5:296–303.-公共医学

[9] De Luca M、Brunetto L、Asteriti IA、Giubettini M、Lavia P、Guarguaglini G.Aurora-A和ch-TOG在控制纺锤极完整性的共同途径中发挥作用。致癌物。2008;27:6539–6549.-公共医学

[10] De Luca M、Brunetto L、Asteriti IA、Giubettini M、Lavia P、Guarguaglini G.Aurora-A和ch-TOG在控制纺锤极完整性的共同途径中发挥作用。致癌物。2008;27:6539–6549.-公共医学

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