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.2014年8月21日；10（8）：e1004553。
doi:10.1371/journal.pgen.1004553。 eCollection 2014年8月。

EF-P依赖性停顿在翻译过程中整合近端和远端信号

萨拉·埃尔加马尔 1, 阿萨夫·卡茨 2, 史蒂文·赫尔希 三, 戴维·纽森 4, 宫田幸季 5, 威廉·威利·纳瓦雷 三, 迈克尔·伊巴 1
附属机构

EF-P依赖性暂停在翻译过程中整合近端和远端信号

萨拉·埃尔加马尔等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

延伸因子P（EF-P）是高效合成具有连续脯氨酸延伸和其他基序的蛋白质所必需的，否则会导致核糖体暂停。然而，以前的报告也表明，大多数含二丙基蛋白的水平不会因efp的缺失而改变。为了确定触发核糖体在二rolyl（PPX）基序上停滞的特定序列，我们使用核糖体分析来监测缺乏EF-P的大肠杆菌菌株中的全局核糖体占有率。只有2.8%的PPX基序在Δefp菌株中引起显著的核糖体停顿，在暂停位置观察到核糖体密度增加了45倍。在翻译过程中产生停顿的PPX基序的比例出乎意料地低，这促使我们研究PPX上游序列的可能作用。我们的数据表明，依赖EF-P的停顿受到PPX模式上游序列的强烈影响。我们发现，核糖体肽基-tRNA位点上游3个密码子的残基对特定PPX基序是否触发核糖体停顿有显著影响，而基序上游的内部Shine Dalgarno序列对EF-P依赖性翻译效率没有影响。特定摊位核糖体占有率的增加与总蛋白质水平的降低没有可靠的相关性，这表明在许多情况下，其他因素可以补偿摊位对蛋白质合成的潜在有害影响。这些发现表明，特定PPX基序启动EF-P缓解失速的能力受到其局部环境的强烈影响，其他间接转录后效应决定了此类失速对细胞内蛋白质水平的影响。

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提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。PPX序列中的翻译暂停。
A类)WT（深灰色）和Δ中PPX序列的暂停指数直方图电子飞行计划菌株（浅灰色）。B类)之后PPX暂停指数的变化直方图电子飞行计划删除。C类)两个基因对类似PPX序列具有不同核糖体占有率的示例。左侧，malE公司包含PNPPK序列，该序列不会产生翻译暂停和向右多维数据集包含一个PEPPK序列，该序列会在翻译中产生停顿。插图显示了完整基因的核糖体占有率。黑色和红色用于两个WT菌株复制品，绿色和蓝色用于Δ电子飞行计划重复，而青色和品红色用于补充菌株重复。图中的值被归一化为相应的基因核糖体占有率平均值。
图2
图2。对aSD亲和力的翻译暂停和PPX前氨基酸身份的影响。
A类)在GFP的N末端引入了编码类似氨基酸模式但具有不同aSD亲和力的不同序列。野生型和Δ电子飞行计划针对mCherry对菌株进行了测量并进行了标准化，mCherrry是作为转录融合克隆的。显示了X密码子第三个核苷酸上游的aSD亲和力6个位置。B类)编码相同氨基酸模式的所有克隆（无论其特定的aSD亲和力如何）的效应分布均以黑线方框图表示（平均值为一个小正方形，平均值为方框的中线，方框极限表示25第个和75第个百分位数）。每个特定克隆的平均值以浅灰色显示。显示了至少三个生物复制的平均值，误差条（表示一个标准偏差）仅显示在A类为了清晰起见。
图3
图3。PPX前氨基酸对暂停效率的影响。
在GFP N端的区域编码处引入了各种序列。在可能的情况下，基因序列要么暂停要么不暂停大肠杆菌使用了（括号中的名称）。A类)PP-基础，B类)聚丙烯酸和聚丙烯疏水，C类)PP-酰胺，D类)PP-羟基和E类)PP-产品。显示了至少三个生物复制的平均值，误差条表示一个标准偏差。
图4
图4。AtpA和AtpD合成对EF-P的依赖性。
A类)核糖体分析和SILAC比值比较atpD和atpA翻译停滞和AtpD和AtpA蛋白水平大肠杆菌和沙门氏菌伤寒杆菌。核糖体分析来自这项工作；†大肠杆菌SILAC数据来自；秒。Typhimurium SILAC数据来自。B类)具有代表性的western blot显示沙门氏菌.DnaK包含在加载控件中。C类)western blot的密度测定定量显示了三个生物复制品中相对于WT的平均AtpD/DnaK比率。误差线表示一个标准偏差。D类)野生型（WT）和电子飞行计划突变体沙门氏菌LacZ被包括为对照，并指出影响PPG基序的特定点突变。比率显示WT/Δ电子飞行计划接种后10小时的GFP荧光标准化为光密度（600nm）。显示了至少三个生物复制的平均值，误差条表示一个标准偏差。
图5
图5。上游残基对AtpD和AtpA合成的EF-P依赖性的影响。
A类)序列(沙门氏菌Typhimurium）的AtpD和AtpA与其PPG图案（粗体）接近。PPG甘氨酸占据A位点时的相对位置如上所示。PPG基序第二脯氨酸在每个蛋白质中的氨基酸位置如下所示。B类)野生型（WT）和电子飞行计划突变体沙门氏菌“Swap”结构表示PPG基序上游特定数量氨基酸的AtpA序列的插入。包括图4中的LacZ、未修改（wt）、P214L和R279P构造以进行比较。比率显示WT/Δ电子飞行计划接种后10小时的GFP荧光标准化为光密度（600nm）。显示了至少三个生物复制的平均值，误差条表示一个标准偏差。C类)如中所示B类，但使用AtpA-GFP翻译融合构建与AtpD上游序列的swap-in。
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