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.2014年10月1日；10(10):1801-13.
doi:10.4161/auto.32136。 Epub 2014年8月5日。

衣霉素和他培沙金诱导的内质网应激对短暂性缺血性脑损伤的保护作用：PARK2依赖性线粒体吞噬的参与

张湘南 1, 杨元 2, 雷江 2, 张晶莹 2, 杰琼高 三, 沈哲 2, 郑燕蓉 2, 田登 2, 海景燕 2, 李文璐 4, 侯伟伟 2, 陆建新 三, 姚深 三, 海冰戴 5, 胡伟伟 1, 张灼华教授 6, 钟晨 1
附属机构

衣霉素和他培沙金诱导的内质网应激对短暂性缺血性脑损伤的保护作用：PARK2依赖性线粒体吞噬的参与

张湘南等。 自噬. .

摘要

短暂性脑缺血导致内质网应激。然而，内质网应激对脑缺血的影响尚不清楚。为了解决这个问题，将内质网应激激活剂衣霉素（TM）和他司加金施加于短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）小鼠和去氧葡萄糖再灌注（OGD-Rep.）处理的神经元。TM和TG均对缺血诱导的脑损伤具有显著的保护作用，表现为脑梗塞体积减少，缺血组织葡萄糖摄取率增加。在OGD-Rep.处理的神经元中，内质网应激释放机制4-PBA抵消了TM和TG对神经元的保护作用，这也支持内质网应力在短暂脑缺血中的保护作用。敲低内质网应激传感器Eif2s1，后者被TM和TG进一步激活，减少OGD-Rep诱导的神经元死亡。此外，TM和TG均能防止PARK2丢失，促进其向线粒体的募集，并在缺血再灌注期间激活线粒体吞噬。TM和TG的神经保护作用通过自噬抑制（3-甲基腺嘌呤和Atg7敲除）和Park2沉默而逆转。Park2（+/-）小鼠的神经保护作用也减弱。此外，Eif2s1和下游Atf4沉默降低了PARK2的表达，损害了有丝分裂诱导，并抵消了神经保护作用。综上所述，本研究表明，TM和TG诱导的内质网应激对短暂性脑缺血损伤具有保护作用。PARK2介导的有丝分裂可能是内质网应激保护的基础。这些发现可能提供了一种通过内质网应激激活诱导有丝分裂来拯救缺血大脑的新策略。

关键词：停车场2；脑缺血；内质网应激；有丝分裂；神经保护。

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数字

无
图1。Tunicamycin（TM）和thapsigargin（TG）对缺血再灌注诱导的脑损伤具有保护作用。小鼠大脑中动脉闭塞1h，取下单丝缝合线允许再灌注。注射指定剂量的TM或TGicv公司再灌注开始时。(A类)MCAO后24小时处死动物，通过条形图中的TTC染色测定梗死体积（平均值±SD，n=6）。(B类)显示了每组具有代表性的TTC染色脑切片。(C类)给出了各组的神经功能缺损评分。(D类)小鼠的MicroPET和MRI图像的代表性共配准。服用3毫克TM、20毫克TG或相同体积的生理盐水国际商用车分别在再灌注开始时；再灌注24小时后，获得小鼠脑T2加权MRI扫描。18在氟烷麻醉下给小鼠注射F-FDG（活性~300 Ci/mmol）。在安静摄取60分钟后，对MicroPET扫描进行20分钟的静态采集。(E类)区域比率与对侧脑摄取量的标准化（平均值±SD，n=4）。采用单因素方差分析和Dunnett法进行统计分析t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001 vs.盐水(B和C)或指定组(E类).
无
图2。Tunicamycin（TM）和thapsigargin（TG）减弱了原代神经元细胞培养中氧-葡萄糖剥夺-再灌注（OGD-Rep.）诱导的凋亡。原代培养的神经元经OGD处理2 h，再灌注期间用指定剂量的TM、TG或4-PBA处理。再灌注24h后，TM处理的细胞凋亡率(A类)、TG(B类)或仅4-PBA(C类)通过TUNEL和DAPI染色测定。(D类)JC-1染色检测线粒体膜电位。(E类)DCFH-DA染色检测活性氧生成。(F类)通过western blot测定细胞液（细胞）和线粒体（有丝分裂）组分中的CYCS水平。(G公司)通过western blot测定裂解型CASP3的表达，半定量水平如条形图所示（平均值±SD，n=3）。采用单因素方差分析和Dunnett法进行统计比较t吨测试**P（P）<0.01和***P（P）与指定组相比，<0.001。
无
图3。在原代培养的神经元细胞中，Tunicamycin（TM）和thapsigargin（TG）进一步激活了氧葡萄糖剥夺再灌注（OGD-Rep.）诱导的有丝分裂。原代神经元培养物经OGD处理2h，再灌注开始时用0.4 nmol/L TG或0.2 ng/L TM处理。(A类)神经细胞先前通过病毒载体感染转染GFP-LC3和Mito-DsRed。再灌注1h后，用共焦显微镜拍摄荧光图像。图片显示了3个独立实验的代表性示例。(B类)列表示每个单元格中GFP-LC3阳性点的数量。在每个独立实验中，对来自一个部分和3-6个部分的至少5个随机场进行平均。条形图显示了来自至少3个独立实验的punta数的平均值±SD；每组至少计数50个细胞。(C类)列表示Mito-DsRed和GFP-LC3的Manders重叠系数。每组至少包括来自3个独立实验的44个细胞。(D类)再灌注6 h后，在有无氯喹的情况下，通过western blot分析测定LC3、SQSTM1、TOMM20和COX4I1蛋白水平。(E类)再灌注6小时后，相对线粒体DNA（mtDNA）水平显示为mt-Atp6型（线粒体编码DNA）/13卢比实时PCR检测细胞核编码DNA比率。(F类)细胞之前用Mito-DsRed标记，再灌注6小时后，通过免疫染色测定SQSTM1。(G公司)这些列表示Mito-DsRed和SQSTM1的Manders重叠系数。每组至少包括来自3个独立实验的29个细胞。实验独立重复至少3次。数据表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析和Dunnett法进行统计比较t吨测试**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与指定组相比。##P（P）与OGD-Rep单独组相比，<0.01。
无
图4。丝裂原抑制阻断了衣霉素（TM）和他昔加林（TG）的保护作用。(A类)小鼠大脑中动脉闭塞1h，再灌注24h后测量梗死体积和神经功能缺损评分。7.5µg 3-甲基腺嘌呤（3-MA）国际商用车在再灌注开始时注射3µg TM、20 ng TG或单独注射。(B类)附件7通过用含有附件7-shRNA(附件7siRNA）；对照细胞用打乱的shRNA处理(Scr.公司。). 通过蛋白质印迹鉴定沉默效应（上图）。然后对细胞进行2 h OGD，然后再灌注24 h，在再灌注开始时给药所有指示的试剂。再灌注24h后TUNEL染色检测细胞凋亡率。(C类)在再灌注开始时用25µmol/L mdivi-1处理细胞，有无TM和TG。再灌注24 h后进行TUNEL染色。数据表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析和Dunnett法进行统计比较t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与指定组相比。
无
图5。PARK2参与了衣霉素（TM）和thapsigargin（TG）赋予的神经保护作用。(A类)对小鼠皮层神经元的原代培养物进行2小时的OGD和1小时的再灌注。再灌注时同时给予0.2 ng/L TM或0.4 nmol/L TG。对照细胞在没有OGD的情况下也经历了相同的处理。免疫细胞化学染色PARK2（绿色）和线粒体标记TOMM20（红色），共聚焦显微镜拍摄图像。(B类)野生型和公园2+/负极用western blot（下面板）检测小鼠皮层。这个公园2+/负极小鼠按照描述接受tMCAO，TM的指示剂量为icv公司再灌注开始时注射。再灌注24小时后测定梗死体积。野生型和公园2+/负极tMCAO 6h后，用western blot（右上板）检测小鼠皮层，无论是同侧（Ips）还是对侧（Contra）。(C类)在皮层神经元的原代培养中，PARK2被针对小鼠的shRNA击倒公园2mRNA。通过western blot（上面板）鉴定沉默效果。OGD 2 h后再灌注24 h后进行TUNEL染色。(D和E)Neuro2a细胞接受4小时OGD，然后再灌注24小时。(D类)用编码pEGFP、pEGFP-PARK2或pEGFP/PARK2ΔUBL的质粒转染Neuro2a细胞。通过GFP的western blot检测转染效果（左面板）。示意图显示了PARK2和PARK1ΔUBL氨基酸序列（右上面板）。再灌注24 h后，用western blot检测各组TOMM20水平。(E类)24小时前用所示质粒转染细胞，再灌注24小时后用MTT法检测细胞活力。数据表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析和Dunnett法进行统计比较t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001与指定组相比。
无
图6。EIF2S1-ATF4信号通路参与膜霉素（TM）和thapsigargin（TG）激活的PARK2介导的缺血神经元线粒体自噬。对小鼠皮层神经元的原代培养物进行2 h OGD，然后进行不同时间的再灌注。同时给予0.2 ng/L TM或0.4 nmol/L TG，再灌注3 h(A类)western blot检测EIF2S1、磷酸化EIF2S1（p-EIF2S1）、ATF4和PARK2水平，以GAPDH水平作为负荷对照。(B类)典型图像显示，细胞被ATF4（红色）免疫染色，细胞核被DAPI（蓝色）标记。计算了各组的ATF4阳性细胞核比率，如右图所示。在每个独立实验中，至少取一个截面和3到6个截面的5个随机场的平均值。(C–E类)原代神经元培养物中的EIF2S1、ATF4和PARK2先前分别通过转染其特定shRNA而被敲除。用打乱的shRNA转染对照细胞(C类)通过蛋白质印迹测定指示组中的TOMM20水平，并检测GAPDH作为负载对照。(D类)影响特征1western-blot（上面板）证实敲除。再灌注24h后用TUNEL染色检测各组细胞凋亡率。(E类)影响附件4western-blot（上面板）证实敲除。再灌注24h后用TUNEL染色检测各组细胞凋亡率。数据表示为平均值±标准偏差。采用单因素方差分析和Dunnett法进行统计比较t吨测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）与指示组相比，<0.001。
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