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.2014年8月15日4:6076。
doi:10.1038/srep06076。

Camello是组蛋白乙酰转移酶的一个新家族，乙酰化组蛋白H4，对斑马鱼的发育至关重要

克莉莎帕尔·卡莫迪亚 1, 克莉莎帕尔·阿纳米卡 2, 维贾伊库马尔·穆利 1, 索拉布·J·普拉丹 1, 吉田公司 1, 桑吉夫·加兰德 1
附属公司

Camello是组蛋白乙酰转移酶的一个新家族，乙酰化组蛋白H4，对斑马鱼的发育至关重要

克莉莎帕尔·卡莫迪亚等。 科学代表. .

摘要

在本研究中，我们基于组蛋白乙酰转移酶（HAT）结构域的存在，研究了小家鼠和斑马鱼基因组中组蛋白乙酰化转移酶（HA Ts）的全基因组发生情况。我们的研究确定了一组缺乏已知HAT家族特征的蛋白质，其大小相对较小，并且没有其他相关结构域。这一未分类组中的大多数蛋白质是Camello蛋白质，这些蛋白质尚不为人所知，并被归类为功能性HAT。我们的体外和体内分析表明，Camello家族蛋白是活性HAT，对组蛋白H4具有特异性。有趣的是，骆驼蛋白是最早发现的显示核周定位的HAT之一。此外，Camello蛋白在进化上在所有脊索动物中都是保守的，并且在进化史上首次在cnidarians中观察到。此外，斑马鱼胚胎中Camello蛋白（CMLO3）的敲除在轴伸长和头部形成方面表现出缺陷。因此，我们的研究确定了一个新的活性HAT家族，该家族对组蛋白H4乙酰化具有特异性，表现出核周定位，并且对斑马鱼的发育至关重要。

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数字

图1
图1。小鼠基因组中HAT同源物的补体。
（A） 在100次自举重采样后，使用MEGA 5.1版的UPGMA方法构建树状图。小鼠HAT的树状图，分为已知的和新的含有Camello蛋白的家族。不同HAT家族的同系物用不同的颜色表示。本研究中确定的HAT新家族“Camello家族”以灰色突出显示。（B） Camello家族7个蛋白序列与GCN5的多重序列比对表明，Camello系列所有成员中都存在乙酰辅酶A结合基序，（C）GCN5和Camello蛋白的一般结构域组织，CMLO3。GCN5的HAT域与其他域相连，而CMLO3只有HAT域。
图2
图2。Camello家族蛋白CMLO3和E0CYR6是活性组蛋白乙酰转移酶。
（A） 利用杆状病毒产生的重组组蛋白H3和H4进行HAT分析。E0CYR6和CMLO3显示组蛋白H4乙酰化（分别为通道2和3）。（全长印迹作为附加文件8提供：图S7）（B）使用位点特异性抗体（H3ac、H4ac和H4K5、8、12ac）的蛋白质印迹。E0CYR6和CMLO3对组蛋白H4乙酰化具有特异性，对组蛋白H1没有活性。所有样品在类似条件下在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行。（C） 凝胶切割组蛋白H3和H4的质谱分析。CMLO3和E0CYR6均被发现乙酰化组蛋白H4上的多个赖氨酸残基（H4K5、H4K8、H4K12和H4K16）。第一列表示质谱肽。第二列显示组蛋白H4上赖氨酸残基的位置。Xcorr是互相关值，高于2.0的Xcorr被认为是良好的相关性。电荷是肽的状态。CMLO3和E0CYR6柱中的X表示这两种蛋白质的正乙酰化。（D） 修饰肽的强度与质量电荷比的完整质谱。
图3
图3。CMLO3具有核周定位。
（A） CMLO3在HeLa细胞中表达为GFP融合蛋白。比较CMLO3-GFP融合蛋白与内质网标记物calnexin的共扩增。CMLO3不与内质网标记物共定位。（B，C）CMLO3具有核周定位，并且它与核周膜标记物Lamin B1共定位。合并图像中的线条表示共同定位的线性荧光轮廓。CMLO3-GFP融合蛋白也存在于CMLO3-GFP融合蛋白过度表达的细胞的细胞质中。（D） 细胞质和细胞核分离后CMLO3-GFP过度表达HeLa细胞的Western blot分析。分别以层蛋白B1和微管蛋白作为核质组分的标记物。CMLO3-GFP主要存在于核组分中。C-细胞质组分；N-核分数。（全长印迹作为附加文件9提供：图S8）（E）CMLO3和E0CYR6的过度表达导致内源性组蛋白H4的乙酰化更高。Tubulin被用作负荷控制。右边的条形图表示通过微管蛋白归一化对凝胶图像的相对蛋白质强度进行量化。CMLO3和E0CYR6的过度表达分别导致内源性希特森H4乙酰化富集1.5倍和2.5倍。
图4
图4。25个CMLO3同源物的多序列比对和邻接树。
（A） 选择在整个长度上与CMLO3表现出显著相似性的蛋白质进行MSA构建。绿色和粉红色方框分别表示CMLO3蛋白序列中预测的跨膜螺旋和乙酰转移酶结构域的位置。MSA的着色基于clustalx。如果其氨基酸保守度超过30%，则位置会被着色。（B） 利用相邻连接方法构建了221个位置的系统发育树。使用100个bootstraps评估统计显著性。两组CMLO3样蛋白在系统发育树的基础上明确划分，显示为棕色和海军蓝色。树以ATS042_NEMVE序列为根。序列标识符可用作以下物种的标识符，人类：智人，小鼠：小家鼠，鸡：五倍子，XENTR:热带非洲爪蟾，丹尼尔：达尼奥雷里奥，制动：花鳃吸虫科和NEMVE：翻译起始因子.
图5
图5。吗啉介导斑马鱼胚胎中CMLO3的敲除。
（A） 18的侧视图 hpf胚胎注射对照MO、CMLO3 MO1和CMLO3 MO2。（B） 堆积条形图，表示注射对照和CMLO3吗啉后正常、死亡或变形的胚胎的百分比。本实验分析了对照组（n=220）、CMLO3 MO1（n=180）和CMLO3 MO2（n=160）注射胚胎，其中n代表注射胚胎数。
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