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.2014年11月13日;515(7526):279-282.
doi:10.1038/nature13701。 Epub 2014年8月10日。

血管结构与生理力的压电集成

附属公司

血管结构与生理力的压电集成

李静(音译)等。 自然. .

摘要

物理力调节内皮细胞以决定血管结构和功能复杂性的机制尚不清楚。对感觉神经元的研究表明,压电蛋白是Ca(2+)渗透性非选择性阳离子通道的亚单位,用于检测有害的机械冲击。在这里,我们展示了压电1(Fam38a)通道作为摩擦力(剪应力)的传感器以及血管结构在发育和成人生理学中的决定因素。小鼠Piezo1的整体或内皮特异性破坏严重干扰了正在发育的血管系统,在心脏跳动的几天内对胚胎致命。单倍体不足不是致命的,但在成熟血管中检测到内皮异常。Piezo1通道作为血流传感器的重要性体现在Piezo 1对剪应力诱发离子电流和内皮细胞内钙内流的依赖性,以及外源性Piezo2对其他抵抗细胞产生剪应力敏感性的能力。在钙内流的下游,存在蛋白酶激活和内皮细胞的空间重组,以施加力的极性。数据表明,压电1通道在血管生物学中起着关键的整合器的作用。

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数字

扩展数据图1
扩展数据图1。主动脉和内皮细胞中的Piezo1 mRNA
用Piezo1引物对人(h.)肝和小鼠(m.)肺内皮细胞(EC)和新鲜分离的小鼠主动脉mRNA进行逆转录酶反应(RT)后获得端点PCR产物,以生成cDNA。b条,至于()但适用于:人类晚期外生长内皮祖细胞(LEPC)和7种类型的人类内皮细胞(动脉、微血管、肺、脐带、心脏、膀胱、真皮、结肠)。结果显示有(+RT)和无(-RT)逆转录。c(c),所示类型实验的定量实时PCR数据()(n=2份,每份一式两份)。d日,所示类型实验的定量实时PCR数据(b条)(n=1份,一式两份)。
扩展数据图2
扩展数据图2。压电1通道在HUVEC迁移和管形成中的作用
在转染对照siRNA(sc.si.)、2种不同的单一Piezo1 siRNA(P1.si.1或P1.si.2)或一组Piezo siRNA(P1.si.3)后,用抗Piezo2抗体对HUVEC裂解产物进行Western blot检测。上部印迹中的上带代表预测质量为286 kDa的压电陶瓷1。紧邻下方的带是未知蛋白质,由抗Piezo1抗体(*)非特异性标记。下部印迹显示β-肌动蛋白作为蛋白质负荷控制物。b条用对照siRNA(sc.si.)或Piezo1 siRNA(P1.si.1)转染后,用抗Piezo 1抗体检测HUVEC裂解物的另一个western blot。箭头指向Piezo1蛋白质。在约130 kDa时,P1.si.1对额外蛋白质的明显消耗是明显的,但在其他实验中,这种效应是不可复制的。其他蛋白质(例如约250(*)、190和100kDa)被抗Piezo1抗体非特异性标记,不受Piezo1 siRNA的影响。没有发现更特异的抗Piezo1抗体。c(c),所示类型的压电1带的归一化定量密度分析(b条)(n=3)。d日TRPV4通道激活剂10μM 4α-佛波醇12,13二酸盐(4-αPDD)对细胞内钙的影响2+荧光平板阅读器上96 well板的多个孔中的HUVEC(代表n=3)。HUVEC转染sc.si.或P1.si.1。数据显示P1.si.1对TRPV4没有影响。e(电子)sc.si转染后细胞迁移与P1.si.1或sc.si.与P1.si.2比较(n=4个)。(f),至于(e(电子))但将车辆控制与5μM GsMTx4或30μM钌红(各3个)进行比较。,的示例图像在体外与成纤维细胞共同培养的试管形成。用sc.si或P1.si.1转染HUVEC,并用抗CD31抗体(绿色)标记。比例尺,400μm。小时,所示类型图像中的管长度分析()与P1.si.2类似(所有组的n=3)。,中的示例节体内Matrigel插头,HUVEC转染sc.si.或P1.si.1。箭头指向典型的管结构。比例尺,50μm。j个,试管的平均数据示例如下()用于6个独立实验(i-vi)(每个实验5-17个组织切片)。误差线为s.e.m。
扩展数据图3
扩展数据图3。全局和内皮特异性压电陶瓷1转基因与小鼠胚胎发育迟缓
,简化图压电陶瓷1KOMP Repository在ES单元中提供的淘汰优先(条件)构造(网址:http://www.komp.org).压电陶瓷1表明含有lacZ序列的插入,其侧翼为鳍状蛋白酶识别靶(FRT)位点和下游loxP位点。有关构造的更多详细信息,请访问网址:http://www.komp.org.b条-c(c),全局修改。b条,使用lacZ或loxP-spaning PCR引物的基因分型结果示例。M表示DNA标记阶梯。左边是6只小鼠的lacZ PCR引物分析结果(预期产物:225 bp)。右边是用针对内源性的引物对相同的6只小鼠进行分析的结果压电陶瓷1测序3′末端loxP位点任一侧(预期产物:155 bp,无loxP部位;189 bp,有loxP位置)。在所示的凝胶中,3只小鼠是构建物的杂合小鼠(+/-),2只纯合子小鼠(−/-),1只野生型小鼠(+/+)。c(c),同胞E10.5胚胎示例图像。左边的胚胎是压电陶瓷1+/+右边的胚胎是压电陶瓷1−/−. 比例尺为1 mm。d日-,内皮特异性修饰。d日,两只小鼠(小鼠1和小鼠2)的基因分型结果示例,均删除了lacZ插入物并传播了Tie2-cre。包括lacZ、loxP插件和Tie2-cre的不存在和存在控件。缺乏β-半乳糖苷酶染色证实lacZ插入物成功删除(数据未显示)。e(电子)例,使用PCR引物分析六个同胞胚胎的基因分型结果,该引物跨越了预期由loxP位点的cre重组酶活性引起的缺失。正向引物为5′FRT位点的5′,如图所示()反向引物为3′loxP位点的3′。缺失后的PCR产物大小预计为379 bp。在胚胎2和6中检测到该产品。在没有缺失的胚胎中没有产生PCR产物,因为它太长而无法扩增(4208bp)。显示379 bp产物的胚胎被指定为“EC-del”,以表示在压电陶瓷1内皮细胞(EC)。被指定为野生型(wt.)的胚胎没有379 bp的产物,只有155 bp的loxP产物(如“无loxP插入物对照”所示d日). 在总共142个胚胎中,57个是EC-del。(f)RT-PCR产物检测同胞胚胎总RNA中的Piezo1 mRNA(Piezo 1 3′PCR引物)(n=3,每个重复)。胚胎中的压电1 mRNA显著缺失,显示379 bp的产物,如(e(电子)).,同胞E10.5胚胎示例图像。左侧的胚胎为野生型,右侧的胚胎包含内皮特异性Piezo1缺失(EC-del.)。EC-del.胚胎和其他任何胚胎的生长都明显受阻。比例尺为1毫米。误差条为s.e.m。
扩展数据图4
扩展数据图4。剪切应力引起的Ca的压电依赖性2+人内皮细胞和小鼠胚胎内皮细胞的事件
,细胞内钙示例2+在用对照siRNA(sc.si.)或Piezo1.si.1(P1.si.1)转染的HUVEC中由微流体剪切应力引起的事件。每条记录道针对1个单元格。在一个P1.si.1细胞中,瞬时钙2+海拔保持不变。这种残余事件可能反映了某些细胞或非Piezo1机制中的Piezo 1耗竭不足。b条,类型实验的平均数据()并将其扩展为sc.si.和P1.si.1(各5个)、sc.si.和P1.si.2(各4个)、载具和2.5μM GsMTx4(各3个)的配对比较。将数据归一化为各自的对照。c(c),针对细胞内钙的抑制绘制了Piezo1 mRNA耗竭的量化图(每个n=4)2+20 dyn.cm诱发的仰角−2将三种不同的Piezo1 siRNA与其对照siRNA进行比较。Ca公司2+数据来自于(b条). 表S3提供了siRNA的序列细节。d日,平均Ca2+20 dyn.cm诱发的信号−2在未感染HUVEC中。在不添加抑制剂(无抑制剂)(n=8)、10μM氯化钆(Gd3+)(n=3),或使用Ca2+从镀液中省略(0 Ca2+)(n=3)。e(电子),加利福尼亚州2+2μM thapsigargin(TG)在缺乏细胞外钙的情况下诱发的释放2+用sc.si.或P1.si.1转染后(每个96 well板20孔)。(f),中所示类型实验的平均数据归一化为sc.si(e(电子))并对钙的上升速度进行了分析2+TG诱发的事件(n=3个)。,类似于(b条)但内皮细胞来自患者肝脏样本,数据未标准化,仅使用P1.si.1(n=3、4、10和5,剪切应力为5、10、15和20 dyn.cm−2).小时,细胞内钙2+在微流控室中测量小鼠胚胎内皮细胞。小时,示例细胞内钙的叠加2+不同盖玻片上2个单细胞内的事件压电陶瓷1+/+和压电陶瓷1−/−同胞胚胎。在15和25 dyn.cm处施加剪切应力−2然后是30 ng.mL−1在将剪切应力保持在25 dyn.cm时引入VEGF−2.,研究的所有VEGF反应细胞的平均值±s.e.Mean数据,如(小时)(n=6+/+,54个细胞;n=5−/−,42个细胞)。图2a以简化形式总结了相同的数据。误差线为s.e.m。
扩展数据图5
扩展数据图5。HUVEC中机械激活单通道的压电依赖性
,例如,在不减去保持电流的情况下,在三个电压下,电池连接贴片中的单通道电流。将−15 mmHg压力阶跃应用于贴片吸管可诱发开放通道单一电流,其总和为标记为O1和O2的两个水平。闭合通道电流用C表示。b条,单一事件的平均振幅,如()并配有一条直线(3个贴片用于−50、−30和−50 mV;1个贴片用于+30 mV)。c(c),包含通道事件的补丁百分比的成对比较()对于转染sc.si.或P1.si.1的细胞,分为两个独立的实验组(每组的n值在括号中)。在第2组中,将细胞贴附的贴片记录细胞暴露10分钟至0.4 mM EGTA,以螯合污染的Ca2+在记录之前,使sc.si.-和P1.si.1-处理的细胞以类似的方式四舍五入;未经此处理(第1组),P1.si.1而非sc.si.细胞趋向于聚集,以响应高钾+在细胞贴附的贴片记录中,用于使细胞膜电位为零的浴液(这种效应的原因尚不清楚,但可能与细胞骨架和粘附的变化有关,如图4所示)。误差线为s.e.m。
扩展数据图6
扩展数据图6。剪切应力引起的Piezo1的重新分布以及Piezo在内皮细胞向剪切应力方向排列中的作用
剪切应力的应用和方向由开放箭头指示,单元格为HUVEC。,左侧图像为单个单元格中的Piezo1-GFP,带有一个方框,指示0分钟和50分钟15 dyn.cm后在中间和右侧图像中展开的区域−2在微流控室中。在左图中,i表示施加剪切应力后细胞变得落后的部分,ii表示领先的部分。比例尺,10μm。b条,所示类型的实验分析()(每个数据点n=8,50分钟时n=7除外),其中i和ii表示单元格的后缘和前缘,如().c(c),轨道振动器引起的24小时剪切应力后的示例细胞。罗丹明phaloidin标记的F-肌动蛋白(红色)和DAPI标记的细胞核(蓝色)。对转染对照siRNA(sc.si.)或Piezo1 siRNA(P1.si.1)的细胞进行配对比较。比例尺,50μm。d日,中所示类型的成对图像的方向分析示例(c(c)).e(电子),至于(d日)但将模拟细胞与P1.si.1转染细胞(各5个)和2.5μM GsMTx4及其载体对照细胞(各4个)进行比较的实验中模式下频率(角度数)的标准化平均数据。在15 dyn.cm的15 h后,也比较了转染sc.si.或P1.si.1的细胞−2在微流控室中(n=3)。误差线为s.e.m。
扩展数据图7
扩展数据图7。内皮型一氧化氮合酶的偶联
,在用Piezo1 siRNA P1.si.1(左侧)或对照siRNA sc.si.1(右侧)转染后,用抗Piezo1抗体探测HUVEC裂解物的蛋白质印迹。在收集细胞裂解物之前,用30 ng.mL处理HUVEC−1用抗Piezo1抗体、eNOS中磷酸化S1177抗体、抗β-肌动蛋白抗体和总eNOS蛋白抗体检测裂解液。右边的文字显示了预期蛋白质的位置。如扩展数据图2a、b所示,抗Piezo1印迹中250 kDa处的非特异性带用*突出显示。b条,P1.si.1转染HUVEC后总eNOS下调的定量数据(n=6)。c(c),VEGF(30 ng.mL)诱发的S1177 eNOS磷酸化(p-eNOS)折叠变化−1)转染对照siRNA(sc.si)的HUVEC中。或Piezo1 siRNA(P1.si.1)(n=3个)。灰色虚线突出显示1倍(即无变化)。d日,VEGF的Western blot(30 ng.mL−1)在主动脉中诱发S1177eNOS磷酸化(箭头)。主动脉从Piezo1+/+或Piezo 1+/-胎仔上分离,并在37岁时平衡o个C在无剪切应力的培养基中培养3 h。然后主动脉暴露于VEGF(30 ng.mL)−1)(+VEGF)或不(-VEGF)10分钟,然后生成裂解物。用eNOS中S1177磷酸化抗体检测蛋白质。标有**的带不包括在分析中。用抗β-肌动蛋白抗体对印迹进行检测,以检测等蛋白载量。e(电子),所示实验类型的平均数据(d日)(每个基因型n=5),如(c(c)).(f)用对照siRNA(sc.si.)或eNOS siRNA转染HUVEC裂解物后进行Western blotting。用抗eNOS(总)抗体检测印迹。,HUVEC在与载体对照、0.3mM L-NMMA孵育0.5小时后迁移到VEGF,或在用sc.si或靶向eNOS的三种siRNA之一转染后48小时(每个n=3;每个与自己的对照配对)。小时,数据解释。误差线为s.e.m。
扩展数据图8
扩展数据图8。内皮细胞对剪切应力的排列缺乏对一氧化氮的依赖性,但与钙蛋白酶偶联
,轨道振动器上诱导的HUVEC对准频率。每个试验条件的数据均归一化为各自的对照。试验条件为0.3 mM L-NMMA(n=3),转染eNOS siRNA(eNOS.si.1),而模拟转染(n=4)。b条,3中所示蛋白质的质谱分析中的蛋白质丰度压电陶瓷1−/−相对于3压电陶瓷1+/+E10.5胚胎。钙蛋白酶-2及其底物在压电陶瓷1−/−胚胎。由于1300多个检测到的蛋白质在Piezo1缺失后保持不变,因此这些影响相对特定;显示了2个示例(肌球蛋白轻链-3和整合素-β1)的数据。c(c),HUVEC中Piezo1-GFP在15 dyn.cm之前(上图)和之后(下图)的荧光图像−2持续50分钟。小实心箭头指向细胞后缘的焦点粘附结构。比例尺,10μm。n=4的代表。误差线为s.e.m。
图1
图1。小鼠胚胎中的Piezo1
,出生或检测为胚胎的数量压电陶瓷1+/+,压电陶瓷1+/−或压电陶瓷1−/−基因型。b条,同胞卵黄囊(包含胚胎)和E9.5胚胎的图像。比例尺,1 mm(c(c)d日)已解剖压电陶瓷1+/+和压电陶瓷1CD31染色的−/−卵黄囊。(c(c))公式9.5。典型的n=11(+/+)和n=8(−/−)。d日,E10.5。典型的n=9(+/+)和n=11(−/−)。e(电子)(f),至于(c(c)d日)野生型(EC-wt.)和内皮特异性除外压电陶瓷1-改良胚胎。e(电子),第9.5页。典型的n=6(EC-wt.)和n=9(EC-del.)。(f),E10.5。典型的n=5(EC-wt.)和n=11(EC-del.)。比例尺,100μm。
图2
图2。剪切应力传感中的Piezo1
,加利福尼亚州2+内皮细胞中诱发的升高压电陶瓷1+/+(n=6)和压电陶瓷1−/−(n=5)E9.5胚胎。b条,暴露于12、5、8和12μL的HUVEC中的全细胞电流。−1过度融合(流动)。c(c),I和ii的I-V如中所示(b条).d日,12μL的配对比较。−1−24 mV时的响应(b条):对照siRNA(sc.si.)n=6,P1.si.1 n=7。e(电子),加利福尼亚州2+未转染HEK 293细胞(非转基因,5个细胞)或转染野生型(WT)Piezo1-GFP(7个细胞)(n=1)。(f),中类型的平均数据(e(电子))以及M2225R突变体(每个n=6)。误差线为s.e.m。
图3
图3。血管内皮细胞排列中的压电1
,来自E9.5的内皮细胞压电陶瓷1+/+和压电陶瓷1−/−胚胎无剪切应力(左)或15 dyn.cm−2如箭头所示。CD31(绿色,仅左侧),F-actin(红色),细胞核(蓝色)。比例尺,50μm。b条,实验的平均数据,如()(n=4+/+,n=5−/−)。c(c),脑动脉压电1 mRNA丰度检测5′和3′压电陶瓷1-中断(n=2个压电陶瓷1+/+和压电陶瓷1+/−).d日大脑动脉标记为CD31(绿色)和细胞核(蓝色)。比例尺,40μm。e(电子),量化体内CD31方向如所示(d日)(n=4个)。误差线为s.e.m。
图4
图4。压电1耦合至calpain
,Calpain活性表示为胚胎在E9.5时的吸光度(abs.)(n=3压电陶瓷1+/+,n=3压电陶瓷1−/−)和E10.5(n=3压电陶瓷1+/+,n=3压电陶瓷1−/−).b条,无剪应力或有剪应力的HUVEC中Calpain活性15分钟(n=3)。GsMTx4(2.5μM)。c(c),HUVEC对准分析,如扩展数据图6d所示,e.试验条件:标称Ca2+-游离克雷布斯溶液(0 Ca2+)(n=3);3μM PD150606(钙蛋白酶抑制剂)(n=3);20μM PD151746(钙蛋白酶抑制剂)(n=3);20μM PD145305(阴性对照)(n=3);25μM CK59(CaMKII抑制剂)(n=3);和6μM CN585(钙调神经磷酸酶抑制剂)(n=3)。d日,数据解释。误差线为s.e.m。

中的注释

  • 内皮压电1:生命取决于它。
    Li J、Hou B、Beech DJ。 李杰等。 频道(奥斯汀)。2015;9(1):1-2。doi:10.4161/19336950.2014.986623。 频道(奥斯汀)。2015 PMID:25558961 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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