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.2014年8月14日；5（8）：e1373。
doi:10.1038/cddis.2014.328。

蛋白酶Omi通过GSK3β/PGC-1α途径调节线粒体生物生成

R Xu先生 1, Q胡 2, Q马 2, C刘 三, G王 4
附属公司

蛋白酶Omi通过GSK3β/PGC-1α途径调节线粒体生物生成

R Xu先生等。 细胞死亡疾病. .

摘要

在mnd2（运动神经元变性2）小鼠中，Omi线粒体蛋白酶活性的丧失会导致线粒体功能障碍、具有帕金森病特征的神经退行性变和过早死亡。然而，这种病理学的详细机制仍不清楚。在这里，我们报道Omi参与线粒体生物发生过程，这与一些神经退行性疾病有关。线粒体生物发生在mnd2小鼠中是缺陷的，线粒体成分、线粒体DNA和线粒体密度的严重降低证明了这一点。Omi裂解糖原合成酶激酶3β（GSK3β），这是一种促进PPARγ辅活化因子-1α（PGC-1α）降解的激酶，以调节PGC-1β，PGC-1是线粒体生物生成的重要因子。在mnd2小鼠中，GSK3β丰度显著增加，PGC-1α丰度显著降低。SB216763对GSK3β的抑制或PGC-1α的过度表达可以恢复mnd2小鼠或Omi-敲除N2a细胞的线粒体生物发生。此外，SB216763治疗后，mnd2小鼠的运动能力有显著改善。因此，我们的研究确定Omi是线粒体生物发生的一种新调节器，参与Omi蛋白酶缺乏诱导的神经退行性变。

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数字

图1
图1
Omi调节线粒体成分。(一)实时RT-qPCR分析显示，线粒体呼吸链和氧化剂代谢组成部分的mRNA水平，包括ATP5B、COX IV、COX II、CytC和ANT1，在大鼠体内的表达降低二氧化锰25天龄小鼠与同龄宽型小鼠的比较。n个=每组3-4人*P（P）<0.05; 单向方差分析。(b条)Western blotting分析显示，COX IV和Cyt C蛋白在脑和脊髓中的丰度降低二氧化锰25天龄小鼠与同龄野生型小鼠的比较。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (c（c）)进行了蛋白质印迹分析，显示Omi的敲低降低了SH-SY5Y细胞中COX IV和Cyt C蛋白的丰度。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (d日)实时RT-qPCR分析显示，在二氧化锰25天龄小鼠与同龄宽型小鼠进行比较。n个=每组3-4人*P（P）<0.05; 单向方差分析。(e（电子）)透射电子显微镜显示，从25日龄起纹状体线粒体的增殖明显减少百万分之二与宽型小鼠比较。箭头表示线粒体正常，箭头表示线粒体受损，N表示细胞核。(（f）)线粒体密度的定量形态测量基于电子显微照片分析（每只动物五个切片，每组三只动物）。放大倍数为×5000。密度分析通过单向方差分析进行量化*P（P）<0.05
图2
图2
奥密克戎蛋白酶活性调节PGC-1α水平。(一)Western blotting分析显示PGC-1α大脑和脊髓中的蛋白质丰度较低二氧化锰25天龄小鼠与同龄野生型小鼠的比较。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (b条)Western blotting分析显示，HA-tag全长Omi，而不是HA单独或HA-tags全长S276C突变Omi增加PGC-1α蛋白质丰度。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (c（c）)Western blotting分析表明，敲除Omi可降低PGC-1αSH-SY5Y细胞蛋白质丰度。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (d日)实时RT-qPCR分析显示NRF-1和TFAM的mRNA水平降低，PGC-1表达降低α未在中更改二氧化锰25天龄小鼠与同龄宽型小鼠的比较。n个=每组3-4人*P（P）<0.05; Δ，无显著性；单向方差分析
图3
图3
Omi抑制GSK3β表达式。(一)Western blotting分析显示GSK3β大脑和脊髓中的蛋白质丰度增加二氧化锰25天龄的小鼠与相同asge的野生型小鼠进行比较。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (b条)Western blotting分析显示，HA-tag全长Omi，而不是HA单独或HA-tags全长S276C突变Omi降低GSK3β蛋白质丰度。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (c（c）)Western blotting分析显示Omi的敲除增加了GSK3βSH-SY5Y细胞蛋白质丰度。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (d日)实时RT-qPCR分析显示GSK3的mRNA水平β未在中更改二氧化锰25天龄小鼠与同龄宽型小鼠的比较。n个=每组3-4个，Δ，无显著性；单向方差分析
图4
图4
葛兰素史克3β是Omi的底物。(一)体外拉下试验表明GST-GSK3β但与His-Omi互动的不仅仅是GST。进行了三个独立的实验。(b条)半决赛体内下拉分析显示GST-S276C突变体Omi（而不仅仅是GST）可下调内源性GSK3β来自脑裂解物。进行了三个独立的实验。(c（c）)免疫沉淀分析显示Omi与GSK3相互作用β在N2a电池中。进行了三个独立的实验。(d日)免疫沉淀分析表明内源性Omi与内源性GSK3相互作用β在老鼠的大脑中。进行了三个独立的实验。(e（电子）)体外裂解试验表明GST-GSK3β被His-Omi割裂，但没有被His-O mi S276C割裂。体外纯化GST-GSK3β与WT或蛋白酶活性S276C-Omi孵育60 蛋白酶缓冲液中的最小值为37 摄氏度。孵育混合物用抗GST或抗GSK3进行western blotting分析β抗体。括号表示蛋白水解片段。进行了三项独立实验
图5
图5
Omi调节PGC-1α通过GSK3β. (一)Western blotting分析显示Omi的敲除降低了PGC-1α蛋白质丰度；然而，使用SB216763（5 μM） 24小时 h.用si-NC或si-Omi转染SHSY-5Y细胞，24 转染后h，用二甲基亚砜或5 μM SB216763另加24 h.通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (b条)Western blotting分析显示Omi的敲除降低了PGC-1α蛋白质丰度；然而，PGC-1α当GSK3β也被击倒了。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (c（c）)Western blotting分析显示PGC-1α大脑中的蛋白质丰度在二氧化锰老鼠；然而，PGC-1αSB216763处理后蛋白质丰度显著增加二氧化锰与DMSO处理的25天小鼠相比二氧化锰老鼠。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (d日)免疫沉淀分析显示PGC-1的相互作用α二甲基亚砜处理后Cdc4显著增加二氧化锰小鼠与野生型小鼠的比较；然而，PGC-1的相互作用αCdc4在二氧化锰SB216763治疗后的小鼠
图6
图6
抑制GSK3βPGC-1的过度表达α恢复Omi影响的线粒体生物发生。(一)实时RT-qPCR检测显示，ATP5B、ANT1、COX II、COX IV、CytC、NRF-1和TFAM的mRNA水平降低；然而，SB216763处理的mRNA显著增加二氧化锰与DMSO处理的25天小鼠相比百万分之二老鼠。PGC-1的mRNA水平αSB216763或DMSO处理后未发生变化二氧化锰老鼠。n个=每组3-4人*P（P）<0.05; Δ表示无意义；单向方差分析。(b条)Western blotting分析显示，COX IV和Cyt C蛋白丰度在二氧化锰老鼠；然而，经SB216763处理的COX IV和Cyt C蛋白丰度显著增加二氧化锰与DMSO处理的25天小鼠相比二氧化锰老鼠。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (c（c）)实时RT-qPCR分析显示，线粒体DNA拷贝数在二氧化锰老鼠；然而，经SB216763处理的线粒体DNA拷贝数显著增加二氧化锰与DMSO处理的25天小鼠相比百万分之二老鼠。n个=每组4人，*P（P）<0.05; 单向方差分析。(d日)实时RT-qPCR检测表明，敲除Omi降低了mtDNA拷贝数的表达；然而，Omi基因敲除的效果被过度表达的PGC-1所挽救α在N2a电池中。通过单向方差分析对三个独立实验的密度分析进行量化*P（P）<0.05. (e（电子）)透射电子显微镜显示二氧化锰老鼠；然而，SB216763治疗的效果得到了挽救二氧化锰与DMSO处理的25天小鼠相比二氧化锰老鼠。箭头表示线粒体正常，箭头表示线粒体受损，N表示细胞核。(（f）)线粒体密度的定量形态测量基于电子显微照片分析（每只动物五个切片，每组三只动物）。放大倍数为×5000。通过单因素方差分析对密度分析进行量化*P（P）<0.05
图7
图7
抑制GSK3β提高二氧化锰老鼠。旋转试验表明二氧化锰与使用二甲基亚砜治疗的宽型小鼠相比，小鼠严重恶化；然而，SB216763处理后的性能显著提高二氧化锰16天、20天、25天和30天龄的小鼠与DMSO处理的小鼠进行比较二氧化锰老鼠。二甲基亚砜和SB216763处理的宽型小鼠没有显著差异。n个=每组10人*P（P）<0.05; Δ，无显著性；单向方差分析
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