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.2014年7月31日;5(7):e1359。
doi:10.1038/cddis.2014.325。

Erlotinib衍生物通过靶向CIP2A激活蛋白磷酸酶2A抑制肝癌

附属公司

Erlotinib衍生物通过靶向CIP2A激活蛋白磷酸酶2A抑制肝癌

H-C余等。 细胞死亡病. .

摘要

蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一种肿瘤抑制因子,在多种癌症中具有功能缺陷。此前,我们发现PP2A活性决定了硼替佐米和厄洛替尼对肝细胞癌(HCC)细胞的抗癌作用。在这里,我们在四种肝癌细胞系PLC5、Huh-7、Hep3B和Sk-Hep1中测试了一种新型埃洛替尼衍生物TD52。使用MTT和流式细胞仪,我们发现TD52在肝癌细胞中比厄洛替尼具有更强的凋亡作用。TD52诱导的细胞凋亡与PP2A的剂量和时间依赖性激活以及蛋白磷酸酶2A(CIP2A)和p-Akt癌抑制剂的下调有关。PLC5细胞中PP2A的抑制或CIP2A或Akt的异位表达消除了TD52的作用。此外,我们证明TD52影响Elk-1与CIP2A基因近端启动子的结合,从而下调CIP2A的转录。重要的是,TD52诱导的肿瘤抑制与体内PP2A的激活和CIP2A和p-Akt的下调有关。总之,我们发现通过抑制CIP2A增强PP2A活性决定了TD52诱导的凋亡效应。我们的发现揭示了这种新型靶向药物的治疗机制,并表明了开发PP2A增强子作为一种新的抗癌策略的治疗潜力和可行性。

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图1
图1
厄洛替尼衍生物TD52对肝癌细胞的促凋亡作用优于厄洛替尼可。()厄洛替尼和TD52对肝癌细胞的促凋亡作用。HCC细胞在指定浓度下暴露于厄洛替尼和TD52 48h、 然后用MTT法测定。集成电路50图中显示了不同细胞中的TD52。点,平均值;钢筋,S.D(n个=3). (b条)TD52和厄洛替尼对肝癌细胞凋亡的剂量依赖性作用。在暴露于指定浓度的埃洛替尼和TD52 24小时后,通过流式细胞术(亚G1)测量HCC细胞的凋亡细胞百分比h.巴,平均值;误差条,S.D(n个=3). (c(c)e(电子))TD52在四种不同肝癌细胞系中的剂量递增效应。在DMEM中用指示浓度的TD52与5%FBS孵育24小时后h(用于western blot和DNA片段测试)和48h(annexin-V/PI双染色法),取肝癌细胞,用annexin V/PI双染法进行分析(c(c))、western blot检测caspases-3、caspases-9和PARP的表达(),和DNA片段测试(e(电子),n个=6). western blotting的数据是三个独立实验的代表。采用流式细胞术对膜联蛋白-V/PI双染色法中的HCC细胞状况进行分析,并将凋亡细胞的比例确定为前凋亡细胞加上晚期凋亡细胞(膜联蛋白V-FITC阳性细胞)的总和。流式细胞术结果详见补充图1。(n个=3). ((f))与z-VAD-fmk联合治疗可降低TD52诱导的促凋亡作用。用TD52(2μM) 有或没有泛酶抑制剂z-VAD-fmk(100μM),用于48h、 然后用western blot(上面板)和流式细胞仪(下面板)对细胞进行分析。()厄洛替尼(上部)和TD52(下部)的结构。(小时)TD52几乎没有EGFR磷酸化活性。厄洛替尼或TD52治疗肝癌细胞24小时通过western blotting测定h和EGFR磷酸化活性
图2
图2
通过抑制CIP2A靶向PP2A依赖性p-Akt下调确定了TD52对HCC细胞凋亡的影响。(b条)TD52以剂量和时间依赖的方式下调肝癌细胞中CIP2A蛋白的表达。用指定浓度的TD52处理肝癌细胞24小时小时()或在1μ指示持续时间M(b条);随后收集细胞裂解物,通过western blot分析CIP2A、P-Akt、Akt蛋白表达。(c(c))经TD52处理后,肝癌细胞PP2A活性增强。在1μM代表24制备h和细胞裂解物以测定PP2A磷酸酶活性。Bar,平均值;误差条,S.D(n个=3). ()TD52对PP2A蛋白表达的影响。在1时用TD52处理细胞μM代表24h,并通过蛋白质印迹测定PP2A亚基的表达。(e(电子))CIP2A-myc的异位表达消除了TD52对PLC5细胞凋亡的影响。用CIP2A-myc转染PLC5细胞48天后h、 细胞在2μM代表24h,流式细胞术分析(G1亚组,右侧)和western blot分析(左侧)。Bar,平均值;误差条,S.D(n个=3). ((f))与OA(一种PP2A抑制剂)联合治疗降低了TD52对P-Akt和细胞凋亡的影响。用TD52(2)处理PLC5细胞μM) 和/或OA(100nM)24h,western blot和流式细胞仪分析。Bar,平均值;误差条,S.D(n个=3). ()siRNA下调PP2A-C降低了TD52在PLC5细胞中的促凋亡作用。细胞首先转染PP2A-C siRNA或模拟48h并用TD52(2)处理μM) 24小时h.流式细胞术分析细胞凋亡,western blot分析P-Akt、PP2A和PARP的表达。Bar,平均值;误差条,S.D(n个=3). (小时)Akt1的异位表达消除了TD52对PLC5细胞凋亡的影响。转染细胞后用Akt-myc转染48h、 细胞暴露于TD52(2μM) 24小时h,western blot和流式细胞仪分析。Bar,平均值;误差条,S.D(n个=3)
图3
图3
TD52通过干扰Elk-1功能下调CIP2A的转录。()TD52以剂量和时间依赖性的方式影响CIP2A的转录。左面板,PLC5细胞按指定剂量(上面板)和时间(下面板)用D52处理;通过逆转录-PCR定量CIP2A mRNA。Bar,平均值;误差条,S.D(n个=3)右面板,用100处理细胞后在TD52存在(低)或不存在(高)的情况下,用western blot检测CIP2A蛋白在全细胞裂解液中的表达。(b条)识别受TD52影响的CIP2A近端启动子区域。首先检测不同剂量TD52的CIP2A启动子活性(上面板)。具有五种不同长度缺失的启动子按照“材料和方法”一节中的详细说明进行构建。然后转染突变克隆或宽型启动子24h、 随后将PLC5细胞暴露于2μM的TD52中,并在24小时后检测荧光素酶活性小时(n个=3*P(P)<0.05,Bar,平均值;误差条,S.D.NS,无显著性)。(c(c))TD52影响PLC5细胞中Elk-1和CIP2A的蛋白表达。在2处与TD52接触后μM代表24h、 裂解PLC5细胞,制备全细胞提取物、细胞质和核组分。western blot分析CIP2A和Elk-1的表达。以管蛋白和层粘连蛋白B作为负荷控制。()抑制Elk-1与CIP2A启动子的结合决定了TD52在PLC5细胞中的作用。左侧面板,对TD52或模拟处理的PLC5细胞进行ChIP分析。CIP2A启动子的代表性序列(上部),指示了Elk-1的假定结合位点。ChIP分析用于评估Elk-1在CIP2A启动子区(下部)的假定结合位点上的DNA结合能力。用所示浓度的TD52处理PLC5细胞16h,并固定用于ChIP测定。产物经PCR扩增,凝胶电泳显示结果。右侧,Elk-1的异位表达降低了TD52在PLC5细胞中的促凋亡作用。用Elk-1-GFP转染细胞48h并暴露于TD52(2μM) 24小时h.巴,平均值;误差条,S.D(n个=3)
图4
图4
临床HCC样本中CIP2A/PP2A/p-Akt的验证体内PLC5裸鼠模型。()PLC5异种移植瘤在TD52-、索拉非尼和载体治疗的裸鼠中的生长曲线。*对<0.05; 点,平均值;钢筋,S.D(n个=6). (b条)western blot分析CIP2A、P-Akt和Akt1在PLC5异种移植瘤中的表达水平。(c(c))分析TD52和车用治疗裸鼠中PLC5异种移植瘤的PP2A活性。*P(P)<0.05; 酒吧,平均值;误差条,S.D(n个=3). ()索拉非尼和TD52对PLC5细胞活性的剂量依赖性影响。以指定浓度用索拉非尼和TD52处理PLC5细胞48用MTT法测定细胞活力。酒吧,平均值;误差条,S.D(n个=3). (e(电子))解释TD52在肝癌细胞中促凋亡作用的信号通路模式。(f–h)临床HCC组织中CIP2A和p-Akt的表达分析。强的典型免疫组织化学模式((f),上部面板),中等(,上部面板)和弱(小时(上图)肝癌组织中p-Akt核表达。虽然CIP2A的代表性免疫组织化学模式很强((f),下面板),中等(,下部面板)和弱(小时,下部面板)癌组织中的细胞质表达。(放大倍数,×200)

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