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.2014年8月15日；5(15):6142-67.
doi:10.18632/oncataget.2178。

AKT调节肿瘤中NPM依赖性ARF定位和p53mut稳定性

加思·汉密尔顿 1, 阿斯温·G·亚伯拉罕 1, 詹妮弗·莫顿 2, 奥利弗·桑普森 三, 达夫尼·E·佩法尼 三, 斯维特拉娜·科罗连科娃 三, 安娜·格拉文达 三, 安杰洛斯·帕帕斯普洛斯 三, 奈杰尔·杰米森 4, 科林·麦凯 4, 欧文·桑索姆 2, 格里戈里·戴安诺夫 三, 埃里克·奥尼尔 三
附属公司

AKT调节肿瘤中NPM依赖性ARF定位和p53mut稳定性

加思·汉密尔顿等。 肿瘤靶点. .

摘要

众所周知，核蛋白（NPM）可以调节ARF亚细胞定位和MDM2活性，以应对致癌应激，但其确切机制尚不明确。在这里，我们描述了NPM和ARF如何在核质中结合形成MDM2抑制复合物。我们发现NPM的齐聚作用驱动ARF的核仁积累。此外，NPM和ARF寡聚体的形成可拮抗MDM2与抑制复合物的结合，从而激活MDM2的E3-酶活性并靶向p53。我们发现NPM-Ser48的AKT磷酸化阻止了导致ARF核质定位、构成性MDM2抑制和p53稳定的寡聚化。我们还表明，ARF促进肿瘤中p53突变的稳定性，并抑制p73介导的p21表达和衰老。我们证明，AKT和PI3K抑制剂可能有效治疗AKT升高且携带p53功能增益突变的耐药肿瘤。我们的结果表明，临床候选AKT抑制剂MK-2206在胰腺癌异种移植模型中促进ARF核仁定位，降低p53（mut）稳定性，增加电离辐射敏感性。对人类肿瘤的分析表明，磷酸化-S48-NPM可能是监测AKT活性和AKT抑制剂治疗体内疗效的有用生物标记物。至关重要的是，我们认为，基于ARF和p53（mut）状态的患者分层理论将有助于涉及PI3K-AKT抑制剂的联合治疗。

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数字

图1
图1。AKT磷酸化丝氨酸48上的NPM并调节NPM的四级结构
（A） 用指示的抗体检测T24细胞的AKT或IgG免疫沉淀物和全细胞裂解物。（B） （顶部）NPM的域结构，突出显示核出口信号（NES）（黄色）、核定位信号（绿色）和核仁定位信号（红色）；（底部）序列比对说明了第一个NES中Ser48的保守性。（C）In-vitro公司在放射性标记（γ）存在下用NPM突变体进行免疫纯化AKT或IgG对照的激酶分析32P） ATP如图所示。（D） 转染空载体（con）、FLAG-NPM-WT或FLAG-NPM S48A的T24细胞的抗-FLAG免疫沉淀物。用指示的抗体探测免疫沉淀物和全细胞裂解物。（E） NPM五聚体环的带状图（俯视图）显示了Ser48磷酸化的空间填充模型，强调了与相邻亚基的空间位阻冲突。模型基于PDB条目2P1B。（F）Npm−/−，p53−/–双零MEF感染了表达FLAG-tagged-myristoylated（myr）-AKT1或HA-taged-myr-AKT2的pBabe逆转录病毒，并与NPM-WT或NPM-S48A联合感染，如图所示。通过温和的半天然凝胶电泳（图S1H）和变性裂解物测定NPM齐聚状态，并用指示的抗体进行检测。
图2
图2。NPM-Ser48的磷酸化调节NPM和p19A的定位
（A）Npm−/−，p53−/–双零MEF被表达FLAG-tagged-myr-AKT1的pBabe逆转录病毒与NPM-WT或NPM-S48A联合感染。细胞固定并用DAPI和抗NPM（左）或抗磷酸-S48-NPM（pS48-NPM）染色。（B） NPM免疫沉淀物和全细胞裂解物Npm−/−；p53−/−用所示抗体检测表达人NPM或NPM-S48A的MEF。（C） 图，使用ImageJ对共焦图像中p19ARF染色强度进行量化。（D）Npm−/−，p53−/–用表达FLAG-tagged-myr-AKT1的pBABE逆转录病毒与NPM-WT、NPM-S48A或S48E组合感染双缺失MEF。细胞固定并用DAPI、抗NPM和抗p19ARF染色。
图3
图3。抑制AKT可促进p14ARF对核仁的稳定和重新定位
（A） 用空白载体（对照）、FLAG-NPM或FLAG-NPM-S48A或（B）转染T24细胞，用DMSO、PI-103（0.4μM）或MK-2206（5μM）处理24小时。细胞固定并用抗NPM（红色）和抗p14ARF（绿色）染色。每个图表示核仁中p14ARF染色强度的量化，并由in-Cell Analyzer 1000自动外荧光显微镜进行。数据表示为平均值±SEM。（C）在所示时间内，用二甲基亚砜、MG-132（10μM，16小时）或MK-2206（5μM）处理Myc-tagged泛素转染的H1299细胞中p14ARF的泛素测定。
图4
图4。抑制AKT通过增加NPM和p14ARF之间的关联促进MDM2活性的增强
（A）Npm−/−，p53−/–用pBABE逆转录病毒空载体和表达FLAG标记的NPM-WT、NPM-S48A或S48E的pBABE感染双缺失MEF。通过拉下Flag标签（中间面板）进行NPM免疫纯化，然后用Flag肽洗脱复合物，随后免疫纯化内源性MDM2（下部面板）。（B） 经MK-2206处理的T24细胞MDM2的核免疫沉淀物（5μM，24小时）。免疫沉淀物和裂解物用指示的抗体进行印迹。（C） 如图所示，用MK-2206（5μM）处理T24细胞。从全细胞裂解物和核提取物中免疫沉淀p14ARF，并通过western blot检测其与NPM和MDM2的相关性。免疫沉淀物和裂解物用指示的抗体进行印迹。（D） 在转染野生型p53、HA标记泛素并用DMSO、MK-2206（5μM）或Nutlin3A（5μM）处理16小时的H1299细胞中进行MDM2和（E）p53泛素化试验，如图所示。用指示的抗体探测免疫沉淀物和全细胞裂解物。
图5
图5。抑制AKT降低p53mut的稳定性
（A） T24细胞和PSN1细胞用MK-2206（5μM）或DMSO处理24小时。细胞固定并用DAPI和抗突变p53（OP29克隆）染色。（B） 在添加含有环己酰胺（100μM）（CHX）和MK-2206（5μM）或二甲基亚砜的新鲜培养基之前，将T24细胞用MK-220（5μM）或二甲亚砜预处理24小时。从处理过的细胞中制备核提取物，并用指示的抗体进行印迹。量化与两种情况下CHX治疗的开始有关*，MK-2206为DMSO对照的40%，但相对评估为1.0。（C） 如图所示，用HA标记的泛素和突变型p53（R175H或R248W）转染H1299细胞。如图所示，用DMSO、MK-2206（5μM）或Nutlin3A（5μM）处理转基因细胞16小时。用所指示的抗体探测p53免疫沉淀物和全细胞裂解物。（D） 如图所示，用非靶向对照或p14ARF siRNA转染T24细胞，并用DMSO、MK-2206（5μM）或NPM齐聚抑制剂NCS348884（4μM）处理（Qi等人，2008）。（E） 用非靶向对照、AKT1或p14ARF siRNA转染T24细胞。如图所示，用NCS348884（4μM）、Nutlin3A（5μM）或DMSO处理细胞。用所示抗体对全细胞裂解物进行检测。（F） KPC小鼠衍生KRASG12D系列p53絮状（p53飞行高度层)、克拉斯G12D系列第53页172H兰特ARF+/+和KRASG12D系列第53页172H兰特农业研究基金−/−如图所示，用MK-2206（1μM）、Nutlin3A（5μM）或DMSO处理胰腺癌细胞。用所示抗体对全细胞裂解物进行检测。
图6
图6。p14ARF在p53mut细胞中具有致癌活性
（A） 用指定剂量的电离辐射治疗后T24细胞的克隆形成存活。照射前用MK-2206（5μM）或DMSO预处理细胞。用所示抗体对全细胞裂解液进行印迹。（B） 如（A）所示，除了细胞在照射前用非靶向（NT）对照或p14ARF siRNA转染。用指示的抗体对全细胞裂解物进行印迹。（C） 如（A）所示，除T24细胞外，用NT或NPM siRNA和siRNA抗性的FLAG-NPMWT或FLAG-NPM-S48A转染T24细胞。用所示抗体对全细胞裂解液进行印迹。对，通过细胞内分析仪1000自动外荧光显微镜定量p14ARF核荧光。数据表示为平均值±SEM。（D）T24细胞（p53Mut）和DLD1细胞（p53 Mut）用PI-103（0.4μM）处理指定时间。条形图显示8小时时p53的相对水平。用所示抗体对全细胞裂解物进行印迹。（E） 用PI-103（0.4μM）处理转染NT或p73 siRNA抗p73的T24细胞16小时。用指示的抗体印迹整个细胞裂解液。（F） KPC小鼠衍生KRAS的克隆存活率G12D系列p53絮状（p53飞行高度层)、克拉斯G12D系列第53页172H兰特ARF+/+和KRASG12D系列第53页172H兰特ARF−/−胰腺肿瘤细胞接受指定剂量的辐射治疗。照射前用MK-2206（1μM）或DMSO预处理细胞。（G） 显示KPC小鼠衍生的KRAS的3D克隆生存的条形图G12D系列第53页飞行高度层、克拉斯G12D系列第53页172H兰特ARF+/+和KRASG12D系列第53页172H兰特6Gy辐射治疗后的ARF−/−胰腺肿瘤细胞。辐射前用MK-2206（1μM）预处理细胞。下部面板显示3D菌落的代表性图像。
图7
图7。AKT的抑制调节p53的稳定性体内与电离辐射协同抑制肿瘤生长
（A） 用MK-2206（60 mg/kg-320 mg/kg）或β-环糊精（1.5 mg/ml）载体治疗裸鼠侧翼建立的PSN1异种移植物（PSN1细胞与LTC-14星状细胞联合注射）。用所示抗体对异种移植瘤进行裂解，并用western blot检测裂解产物。（B-D）连续三次服用MK-2206（60 mg/kg）的PSN1异种移植物切片。（B） PSN1异种移植物切片和体外PSN1细胞固定并用抗NPM（红色）和抗p14ARF（绿色）染色。（C） 用MK-2206或载体处理的PSN1异种移植物用DAPI染色，用抗p53（DO1）或p53mut（OP29克隆）（D）染色。（E） 在无胸腺裸鼠侧翼建立的PSN1异种移植物用两天交替剂量的MK-2206（60mg/kg）或载体皮下注射。随后用单剂量IR（6 Gy）治疗小鼠，并用卡尺定期测量肿瘤体积。虚线表示250 mm处的肿瘤生长差异三.
图8
图8。人类肿瘤中磷酸S48-NPM与p53水平相关
（A） 用pS48-NPM对来自肺、胰腺、宫颈、结肠和乳腺的正常组织和肿瘤组织的组织微阵列切片（US Biomax）进行染色。所有图像均为5倍放大，比例尺代表200μm。表2显示了通过自动Aperio扫描分析的样品总数以及低、中或高染色程度的样品总数。（B） （左）来自乳腺肿瘤微阵列的数据显示，那些标记为EGFR/HER2阳性（低和高）或雌激素受体（ER）+ve的核心中磷酸-S48-NPM染色的程度。（右）核心中磷酸S48-NPM染色对p53的评分为低、中或高。（C） 散点图显示了人类胰腺导管腺癌中自动化总pS48 NPM和核磷酸-S473-AKT染色的双变量相关性（n=122，左），或p53阳性样本中的细胞质pS48 NPM（n=81，右）。下面是比较pS48-NPM变化的代表性图像细胞胰腺导管腺癌微阵列切片评分。
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参考文献

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