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.2014年10月；88(19):11540-55.
doi:10.1128/JVI.01745-14。 Epub 2014年7月23日。

一种有效的登革热病毒衣壳抑制剂作用模式的表征

彼得罗·斯卡特罗 1, 尤妮·玛格丽特·劳拉·特里斯特 2, 大卫·保罗 1, 库马尔 1, 埃莉安娜·G·阿科斯塔 1, 切尔西·M·伯德 三, 罗伯特·乔丹 三, 安德烈亚·布兰克尔 2, 拉尔夫·巴滕施拉格 4
附属公司

一种有效的登革热病毒衣壳抑制剂作用模式的表征

彼得罗·斯卡特罗等。 J维罗尔. 2014年10月.

摘要

登革热病毒（DV）是一种严重的全球健康负担，每年有多达4亿人感染，约有50万感染者发展成威胁生命的疾病。尽管尝试开发候选疫苗和抗病毒药物，但缺乏经批准的治疗DV感染的药物。我们以前曾报道过ST-148的鉴定，它是一种小分子抑制剂，在体内外对DV具有广泛而有效的抗病毒活性（C.M.Byrd等人，《抗菌剂化学》，57:15-252013，doi:10.1128/AAC.01429-12）。在本研究中，我们结合生物化学、病毒学和基于图像的技术，研究了这种有希望的化合物的作用模式。我们确认ST-148以衣壳蛋白为靶点，并获得了双峰抗病毒活性的证据，该活性影响感染性DV颗粒的组装/释放和进入。重要的是，通过使用强大的生物发光共振能量转移分析，我们观察到衣壳自身相互作用的增加依赖于ST-148。这些结果得到了分子模型研究的证实，该研究还揭示了一个似是而非的模型，即化合物与衣壳蛋白结合并被一种明显的抗性突变抑制。这些结果表明，ST-148增强的衣壳蛋白自相互作用可能通过诱导结构刚性干扰DV核衣壳的组装和拆卸。因此，如之前报道的其他包膜病毒，稳定衣壳蛋白结构是一个吸引人的治疗概念，也适用于黄病毒。

重要性：登革热病毒是由节肢动物传播的病毒，对全球健康造成重大负担。它们感染了多达4亿人，是世界亚热带和热带地区的地方病。目前，预防或治疗DV感染既没有疫苗，也没有批准的治疗药物。本研究报告了ST-148的作用模式特征，ST-148是一种小分子衣壳蛋白抑制剂，对所有DV血清型具有强大的抗病毒活性。我们的结果表明，ST-148稳定了衣壳蛋白的自相互作用，从而可能通过诱导结构刚性干扰病毒核衣壳的组装和拆卸。反过来，这可能会干扰病毒RNA从进入的核衣壳（未包覆）中的释放以及子代病毒颗粒的组装。正如之前报道的其他包膜病毒一样，我们提出衣壳作为黄病毒抑制剂的一个新的易处理靶点。

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数字

图1
图1
本研究中使用的结构物示意图和ST-148的抗病毒效力。（A） 基因组和亚基因组结构的示意图。DV2全长基因组显示在顶部（DV）。描述了5′和3′N末端区域及其假定的二级结构。多蛋白裂解产物用垂直线分开，并按照引言中的规定进行标记。DVR2A是通过在衣壳环化序列（CAE）之前插入Renilla荧光素酶编码序列，然后插入Tosea asigna病毒2A裂解位点，从DV2全长基因组中获得的。中间面板描述了用于生产反式-补充DV颗粒（DV传输控制协议). sgDVR2A是一种亚基因组报告复制子，通过衣壳和prM/包膜蛋白瞬时表达于反式通过两种不同的慢病毒（分别为pWPI衣壳-BLR和pWPI prME-Puro）。所有结构均源自DVs2 16681隔离物（17）。右侧面板描述了用于BRET实验的构造。YFP和Renilla荧光素酶蛋白被N端融合到DV2（16681株）的衣壳或NS4A。（B） ST-148的结构。（C） ST-148的抗病毒效力。将Huh7细胞感染0.1的DV或DVR2A报告病毒MOI，感染含有或不含有抗性突变S34L的病毒，在37°C的温度下，在不同浓度的化合物存在下持续60分钟。去除接种物并用PBS多次洗涤后，用含有不同浓度ST-148或DMSO的新鲜培养基培养细胞。48小时后，用VeroE6细胞进行PFU分析，测定释放到上清液中的病毒量。数据表示两个独立实验的平均值和误差范围。
图2
图2
ST-148不影响病毒RNA复制，但减少感染性DV颗粒的产生。（A） ST-148对DVR2A报告病毒的复制动力学无影响。Huh7细胞在37°C下以0.1或1的MOI感染DVR2A 4小时，用PBS洗涤，并用含有5μM ST-148或DMSO的新鲜培养基培养。在感染后的指定时间点，按照材料和方法中的描述测量裂解液中的荧光素酶活性。请注意，由于图形的大小，错误栏很难看到。（B） 通过ST-148减少病毒生成。感染细胞经5μM ST-148处理后的上清液在感染后72 h收获，用于感染原始Huh7细胞。48小时后，收集细胞并测定荧光素酶活性。（C） DVR2A和DVR2A的复制动力学比较S34升无论是否有ST-148。Huh7细胞用10μg在体外野生型DVR2A或DVR2A的转录本第34页（S34L），4小时后，向培养基中加入5μM ST-148或DMSO。在底部指定的时间点，测定荧光素酶活性。（D） DVR2A-和DVR2A抑制病毒生成S34升-ST-148处理后转染细胞。感染72小时后，取转染细胞和ST-148处理细胞的上清液，用于感染原始Huh7细胞。48小时后，收集细胞并测定荧光素酶活性。每个面板中显示的数据代表三个独立实验的平均值和标准偏差（***，P（P）< 0.001; *,P（P）< 0.05).
图3
图3
ST-148对感染性DV颗粒释放的抑制作用，如单循环实验所示。（A） ST-148治疗后产生感染性细胞外DV。（B） 释放病毒RNA的定量。Huh7细胞在37°C的MOI为1的条件下感染DVR2A 4小时，用PBS洗涤，并用新鲜培养基（未处理的[NT]）或含有DMSO的培养基或给定浓度的ST-148培养。48小时后，将澄清的上清液用于TCID50定量感染性滴度的试验或两步qRT-PCR定量释放到上清液中的病毒RNA数量。使用单向方差分析和Dunnett’s分析数据事后（post-hoc）测试（**，P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001). （C） 感染效率的测定。细胞感染了DV或DVS34升48小时后固定，并使用DV E特异性抗体进行免疫荧光分析。核DNA用DAPI染色。面板右下角的数字是指感染细胞的百分比（至少1500个细胞的平均值±标准偏差）。（D和E）ST-148对单轮DV颗粒释放的影响。Huh7细胞感染了DV或DVS34升48小时，用PBS广泛清洗，并用含有0.1%二甲基亚砜、1μg/ml布氏菌素A（BFA）或10μM ST-148的培养基培养12小时。通过TCID定量释放的传染性和病毒RNA50检测和qRT-PCR。结果表示至少3个独立实验的平均值和标准偏差。（ns，无显著性；*，P（P）< 0.05; ***,P（P）< 0.001).
图4
图4
ST-148还抑制DV颗粒进入。（A） 用于生产的系统示意图反式-互补DV粒子（DV传输控制协议). 用10μg封端的293T细胞进行电穿孔在体外亚基因组复制子sgDVR2A的转录物（片段1）。第二天，用表达结构蛋白衣壳（野生型或含有ST-148抗性突变S34L）和prM-E（片段2）的慢病毒瞬时转导细胞。复制病毒RNA包装在反式（段3），导致DV传输控制协议释放到培养上清液中并在转导后4-6天收获的砧木（第4段）。（B） ST-148对DV进入的影响传输控制协议Huh7细胞感染DV传输控制协议（WT或S34L突变体）在37°C下保持90分钟。移除接种物并添加新鲜培养基。在图表底部指定的时间点，介质被含有10μM ST-148或0.1%二甲基亚砜的介质取代。在一个病例中（−120分钟），细胞在感染前用ST-148预处理2小时。在感染后48小时收集细胞，并测量裂解液中的荧光素酶活性。（C） ST-148无杀病毒作用。DV WT或DV库存S34升用10μM ST-148或0.1%二甲基亚砜在37°C下培养1小时，并通过限制稀释试验（TCID）测定感染性滴度50). 数据表示三个独立实验的平均值和标准偏差（ns，无显著性；*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.001).
图5
图5
ST-148对病毒RNA和蛋白质亚细胞定位以及内质网堆积中DV颗粒积累的影响。（A） ST-148处理细胞中衣壳与dsRNA和LDs的克隆化。在MOI为1时用DV-WT感染Huh7细胞，4小时后，向培养基中添加DMSO或10μM ST-148。48小时后，用4%蔗糖中的4%PFA固定细胞。为了可视化细胞溶质LD相关衣壳蛋白，用0.1%Triton X-100渗透细胞，并用兔多克隆抗衣壳抗体、小鼠抗dsRNA抗体和Bodypy-488培养细胞（检测LDs）。比例尺代表10μm。（B和C）ST-148分别对LD大小和数量的影响。使用ImageJ的斐济插件计算了每个细胞的平均面积和LD数。每个数据集表示每个条件下至少500个单元格的平均值和标准偏差（a.u.，任意单位；*，P（P）< 0.05). （D） ST-148处理后ER堆中DV颗粒的累积。Huh7细胞感染DV-WT或DVS34升突变株（S34L），MOI为3。感染后4小时，取出接种物，在10μM ST-148或DMSO存在下培养细胞44小时。按照材料和方法中的描述，通过透射电子显微镜对细胞进行固定、处理和分析。左侧面板中方框中的区域在右侧以较高的放大倍数显示。每个面板中的比例尺代表200 nm。（E） 细胞内DV颗粒分布的定量。对ER堆叠中存在的病毒粒子的数量进行量化，并根据每个堆叠的病毒粒子数量将其分为3类。每一列代表每种条件下来自至少15个感染细胞的至少1000个病毒粒子的平均值。
图6
图6
ST-148诱导衣壳蛋白在核不溶性聚集体中积累。（A） ST-148处理后衣壳蛋白的细胞内分布。Huh7细胞感染了DV或DVS34升在MOI为1和4小时后，向培养基中添加DMSO或10μM ST-148。48h后，用4%多聚甲醛固定细胞，用0.5%Triton X-100渗透，用小鼠单克隆抗体对衣壳进行免疫染色。比例尺代表20μm。（B） 衣壳蛋白细胞内分布的基于图像的量化。通过分别量化细胞核（N）和细胞质（C）中检测到的衣壳特异信号，并计算平均荧光比率，确定衣壳的核定位程度(F类)在这两个隔间里[F类（N/C）]。结果表示平均值±标准误差(n个≥ 50). 使用Tukey的单向方差分析对数据进行分析事后（post-hoc）测试（***，P（P）< 0.001; ns，无显著性）。（C） DV蛋白的亚细胞分离。Huh7细胞感染了DV或DVS34升在MOI为1和4小时后，用DMSO或10μM ST-148处理细胞。通过Western blotting评估衣壳蛋白在可溶性细胞溶质（Cyt）、膜相关（Membr）、核（Nuc）和核后不溶物（Post-Nuc）组分中的细胞内分布。GAPDH、ATP5B、层粘连蛋白A/C和波形蛋白作为不同组分的特异性对照。每个通道下方的数字是指通过密度测定法测定的C蛋白的相对数量。减去背景后，将每个分数中的衣壳特异性信号归一化为相应的输入，并表示为四个分数中总信号的倍数。左边的数字表示分子量标准的位置（单位：千）。显示了两个独立实验的一个结果。
图7
图7
ST-148增加了DV衣壳蛋白的自我作用。（A） 由BRET测定WT和S43L衣壳的自相互作用动力学。DSA在活的293T细胞中进行，与越来越多的YFP标记和恒定数量的编码WT或突变（S34L）衣壳或NS4A的Rluc-标记质粒共同转染，作为阴性对照。48小时后，添加Renilla荧光素酶底物coelenterazine H诱导能量转移x个轴显示了在加入柯来替嗪之前测得的受体归一化荧光（netYFP）与施主荧光之间的比值。布雷特50在面板的右上角给出了反映受体蛋白对供体蛋白的相对亲和力的值（发生50%最大BRET时的netYFP/Renilla比率）。曲线表示一个代表性实验结果的平均值±标准偏差，一式三份。使用非线性回归方程拟合曲线，其中假设有一个单一的结合位点。（B） ST-148对衣壳自身相互作用的影响。将1μg YFP衣壳和20 ng Rluc衣壳（WT和S34L）转染293T细胞。转染前，向培养基中添加不同浓度的ST-148或DMSO，48小时后测量BRET（***，P（P）< 0.001; *,P（P）< 0.01).
图8
图8
ST-148和DV衣壳的对接模型以及大分子衣壳蛋白相互作用的可能稳定性。（A） DV血清型1至4和选定黄病毒衣壳氨基酸序列的序列比较。丝氨酸34的位置以红色突出显示。使用ClustalW算法对以下分离物进行序列比对，该算法可在Uniprot网络服务器上获得：DV-2（泰国/16681-PDK53）、DV-1（巴西/97-11/1997）、DV-3（马提尼克/1243/1999）、DV-4（泰国/0348/1991）、West-Nile病毒（WNV；H442）、黄热病病毒（YFV；象牙海岸/1999）、日本脑炎病毒（JEV；SA-14）、昆津病毒（KUNV；MRM61C）和圣路易斯脑炎病毒。UniprotKB的登录号在材料和方法中给出。（B） 分子动力学（MD）模拟结果。在ST-148缺失（左）或存在（右）的情况下，WT衣壳四聚体的稳定构象。衣壳二聚体用蓝色和橙色表示，每个单体用相同颜色的不同色调表示。ST-148显示为绿色棒，位置34处的丝氨酸残基用Corey-Pauling-Koltun（CPK）模型表示。补充材料中给出了MD模拟的电影。（C） 左侧显示了在没有ST-148（红带）或有ST-148的情况下WT C四聚体的MD模拟的叠加结果。ST-148与CPK型号一起显示为绿色。右面板中显示了相同颜色代码的相同叠加的更近视图。虚线箭头表示结构重排，发生在ST-148结合的α2和α3螺旋上，允许调节配体。（D和E）ST-148对接姿势的特写视图。（D） WT衣壳二聚体界面与ST-148复合。（E） 与面板D所示界面相同，丝氨酸残基叠加在Leu34上。虚线圆圈强调了位置34处亮氨酸残基诱导的空间位阻，阐明了突变是如何阻碍这种结合姿势的。在两个面板中，一个二聚体以浅蓝色表示，而另一个衣壳二聚体在WT的情况下以红色表示，在S34L抗性突变体的情况下则以黄色表示。蛋白质残基显示为线条，而Ser34和Leu34则用棒状表示法绘制。
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