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.2014年12月15日；23(24):3021-33.
doi:10.1089/scd.2013.0634。

通过抑制TGFβ/激活素信号通路从犬诱导多能干细胞衍生间充质基质细胞

迪恩·J·惠特沃斯 1, 杰西卡·弗里斯, 托马斯·J·R·弗里斯, 德米特里·A·奥夫钦尼科夫, 贾斯汀·库珀·怀特, 安永J Wolvetang
附属公司

通过抑制TGFβ/激活素信号通路从犬诱导的多能干细胞中获得间充质干细胞

迪安·J·惠特沃思等。 干细胞开发. .

摘要

在本研究中，我们通过小分子抑制转化生长因子β（TGFβ）/激活素信号通路，从犬诱导的多能干细胞（ciPSCs）中生成犬间充质干细胞（MSCs），也称为间充质细胞（mesenchymal stem cells）。这些ciPSC-衍生MSCs（ciPSC-MS）表达MSC标记物CD73、CD90、CD105、STRO1、cPDGFRβ和cKDR，以及多能性因子OCT4、NANOG和REX1。ciPSC-MS对H3K27me3缺乏免疫染色，表明它们具有两条活性X染色体。ciPSC-MS具有高度增殖性，沿骨、软骨和脂肪生成途径进行强有力的分化，但在体外不形成畸胎瘤样组织。对于ciPSC-MS的翻译潜能具有进一步意义，我们表明这些细胞可以被包裹并维持在可注射的水凝胶基质中，当用结合的戊聚糖-多硫酸酯进行功能化时，可以显著增强软骨生成并抑制成骨。能够从ciPSC中高效地获得大量高度增殖的犬MSC，这些MSC可并入可注射的功能化水凝胶中，以增强其沿所需谱系的分化，这是开发有效的MSC治疗犬骨关节炎的重要里程碑，但同样也为评估治疗人类退行性关节疾病的类似方法的有效性和安全性提供了一个模型系统。

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数字

<b>图1</b>
图1。
转化生长因子β（TGFβ）/激活素I型受体抑制剂（SB431542）诱导犬诱导多能干细胞（ciPSCs）分化为具有间充质干细胞（MSC）样形态的细胞。（A）ciPSC形成紧凑、略呈圆顶状的菌落。（B）在用SB431542培养的10天内，ciPSC被组织成单层，呈现立方到星状外观，大多数星状细胞位于菌落外围。（C）传代到塑料和MSC培养基中后，星形细胞均匀分布为单个细胞，而不是上皮样片。这些ciPSC衍生MSC（ciPSC-MS）来自ciPSC克隆A。（D）来源于ciPSC克隆B的ciPSC-MS在形态学上与克隆A的ciPSC无法区分。（E）从骨髓中分离出的成人MSC和从成人脂肪组织中分离出来的MSC具有非常相似的星形外观（F）.（G）第10代的ciPSC仍然显示用于重编程的所有六个转基因的稳健表达。到第26代，转基因已被转录沉默（Whitworth等人[26]），同样，第57代ciPSCs产生的ciPSC-MS保持了转基因的转录沉默。犬科动物β-肌动蛋白作为阳性对照。（H）来自iPSC克隆和成人脂肪和骨髓来源MSCs的ciPSC-MS显示正常染色体数为78，有两条X染色体。
<b>图2</b>
图2。
ciPSC-MS表达MSC表面标记。来自iPSC克隆（ciPSC-MSC A和B）和成人骨髓源性MSCs（BM-MSCs）的ciPSC-MS表达MSC表面标记CD73（A–C），CD90（D–F），CD105（G–I）和STRO1（J–L）用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）可视化细胞核(蓝色).
<b>图3</b>
图3。
大多数ciPSC-MS表达MSC表面标记。（A）荧光活化细胞分选分析确定大多数ciPSC-MS表达MSC表面标记。黑色，阴性对照；蓝色，成人骨髓源性间充质干细胞；绿色，来自ciPSC克隆A的ciPSC MSC；黄色的，来自ciPSC克隆B的ciPSC-MS。（B）与骨髓源性MSC相比，ciPSC-MS对MSC表面标记物阳性的百分比稍高。
<b>图4</b>
图4。
ciPSC-MS表达多潜能因子。ciPSC-MS和成人骨髓源性MSCs显示多潜能因子OCT4的稳健表达（A–C）、NANOG（D–F）和REX1（G–I）DAPI染色如所示（a–i）和中的合并图像（a′–i′）.
<b>图5：</b>
图5：。
ciPSC-MS同时表达多能性和MSC特异性因子。（A）逆转录聚合酶链反应证实犬的表达华侨城4号和NANOG公司ciPSC-MS和成人脂肪和骨髓源性MSC。犬科动物β-肌动蛋白作为阳性对照。（B）ciPSC-MS和成人MSC，但不是ciPSC，表达MSC标记物PDGFRβ和KDR公司.犬类β-肌动蛋白作为阳性对照。
<b>图6</b>
图6。
ciPSC-MS和成年MSCs具有两条活性X染色体。（A）H3K27me3的荧光免疫细胞化学鉴定无活性X染色体（Xi）(箭头)在犬成体真皮成纤维细胞的细胞核中。（B）虽然H3K27me3的扩散免疫染色存在于ciPSC的细胞核中，但它们缺乏与Xi相关的H3K27me3免疫染色的密集积累，表明存在两条活性X染色体（XaXa）。（C）来源于iPSC克隆A和克隆B的ciPSC MSC（D），同样缺乏对Xi的免疫染色，这表明与ciPSC一样，它们是XaXa。（E）从骨髓中分离出的成人MSC也有两条活性X染色体。DAPI染色如所示（a–e）和中的合并图像（a′–e′）.
<b>图7</b>
图7。
ciPSC-MS显示出强劲的生长动力学。（A）来自骨髓或脂肪组织的ciPSC-MS的增殖率高于成人MSC。（B）ciPSC-MS的累积人口倍增也大于成年MSC。
<b>图8</b>
图8。
ciPSC-MS经历成骨、软骨和脂肪生成。（A）在成骨条件下，ciPSC-MS显示出强劲的成骨能力，如茜素红染色的大范围区域所示。（B）软骨原性培养条件导致糖胺聚糖（GAG）沉积，糖胺聚糖在pH 1.0下用Alcian蓝染色呈阳性。（C）脂质TOX红阳性染色显示ciPSC-MS容易分化为含有脂滴的脂肪细胞。DAPI染色显示细胞核(蓝色).
<b>图9：</b>
图9：。
ciPSCs，而不是ciPSC-MS，在体外形成畸胎瘤样组织。ciPSCs在体外形成畸胎瘤样结构，其中包含三个胚层的组织衍生物，包括（A）脂肪组织(箭头),（B）红细胞，以及（C）中胚层骨。（D）内胚层纤毛柱状上皮（纤毛由箭头).（E）外胚层的角蛋白。（F）然而，ciPSC-MS在体外不形成畸胎瘤样组织。相反，有成簇的脂肪细胞(箭头)和小面积钙化基质类似骨（b）。（G）成人脂肪来源的MSC同样形成脂肪细胞簇(箭头)小面积骨骼（b）。
<b>图10</b>
图10。
ciPSC-MS封装在水凝胶中后仍能存活。（A）在水凝胶基质中封装后，将ciPSC-MSC/水凝胶复合物置于培养板中。（B）在水凝胶的三维条件下，细胞采用圆形形态，在21天的培养期内保持不变。（C）通过苏木精和伊红染色评估细胞/水凝胶复合物的结构。21天后，所有水凝胶基质中的细胞分布相对均匀，圆形细胞位于腔隙状结构中。任何水凝胶组合物或培养基配方之间的细胞形态均无显著差异。
<b>图11：</b>
图11：。
水凝胶在体外支持软骨形成和成骨。GAG沉积的阿尔西安蓝染色作为软骨分化的标志。（A、B）ciPSC-MS与聚乙二醇（PEG）水凝胶结合并维持在基础培养基或软骨形成培养基中，不会产生可检测到的GAG水平。（D、E）含有透明质酸（HA）的水凝胶显示背景染色，但没有GAG沉积。（G）在基本培养基中维持的PEG/HA+HA-苯骈多硫酸酯（PPS）水凝胶中，ciPSC-MS不产生GAG。（H）然而，阿尔西安蓝染色强烈的区域(箭头)在软骨生成介质中PEG/HA+HA-PPS水凝胶中的ciPSC-MS周围和之间可见GAG沉积。（C）在成骨培养基中培养的PEG水凝胶中可见大量茜素红阳性沉积物。（F、I）相反，PEG/HA水凝胶中的分化显著减少，HA-PPS完全消除了分化。
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