Japanese encephalitis virus replication is negatively regulated by autophagy and occurs on LC3-I- and EDEM1-containing membranes

doi:10.4161/auto.29455

.2014年9月；10(9):1637-51.

doi:10.4161自动29455。 Epub 2014年7月16日。

乙型脑炎病毒复制受自噬负调控，并发生在含有LC3-I-和EDEM1-的膜上

附属公司

¹疫苗和传染病研究中心；转化健康科学技术研究所；印度哈里亚纳邦古尔冈；生物技术部；理学院；贾米娅·哈姆达德；印度新德里。
²疫苗和传染病研究中心；转化健康科学技术研究所；印度哈里亚纳邦古尔冈。
³生物技术部；理学院；贾米娅·哈姆达德；印度新德里。

PMID： 25046112
预防性维修识别码： PMC4206540型
内政部： 10.4161/自动29455

乙型脑炎病毒复制受自噬负调控，并发生在含有LC3-I-和EDEM1-的膜上

马尼什·夏尔马等。自噬. 2014年9月.

.2014年9月；10(9):1637-51.

doi:10.4161/auto.29455。 Epub 2014年7月16日。

附属公司

¹疫苗和传染病研究中心；转化健康科学技术研究所；印度哈里亚纳邦古尔冈；生物技术部；理学院；贾米娅·哈姆达德；印度新德里。
²疫苗和传染病研究中心；转化健康科学技术研究所；印度哈里亚纳邦古尔冈。
³生物技术部；理学院；贾米娅·哈姆达德；印度新德里。

PMID： 25046112
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内政部： 10.4161/自动29455

摘要

自噬是一种溶酶体降解途径，具有多种生理功能，在几种病毒感染中起着关键作用。在这里，我们研究了自噬在JEV（一种嗜神经性黄病毒）生命周期中的作用。JEV感染导致几种细胞类型的自噬诱导。JEV在神经元细胞中的复制显著增强，其中自噬因ATG7缺失而功能失调，在Atg5缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，JEV复制导致病毒滴度升高。自噬在感染的早期阶段是有功能的，但随着感染的进展，自噬会出现功能障碍，导致错误折叠的蛋白质积累。自噬缺陷细胞对病毒诱导的细胞死亡高度敏感。我们还观察到以非结构蛋白1（NS1）和dsRNA标记的JEV复制复合物与内源性LC3共定位，但与GFP-LC3不共定位。在Atg5缺陷的MEFs中也观察到NS1和LC3的共定位，其仅含有非脂化形式的LC3。病毒复制复合物还显示与ER相关降解（ERAD）途径的标记EDEM1（ER降解增强剂，甘露糖苷酶α样1）有关。我们的数据表明，病毒复制发生在ERAD-衍生的EDEM1和LC3-I阳性结构（称为EDEMosomes）上。虽然ERAD调节因子EDEM1和SEL1L的沉默抑制了JEV的复制，但LC3的缺失产生了深刻的抑制作用，RNA水平和病毒滴度显著降低。我们的研究表明，虽然自噬主要是JEV的抗病毒药物，可能与JEV疾病进展和发病机制有关，但非脂化LC3在病毒生命周期中发挥着重要的自噬独立功能。

关键词：附件5；EDE小体；MEF；NS1；神经2a；黄病毒。

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数字

**图1。**JEV感染导致宿主细胞中自噬体的积累。(**A–C**)转染GFP-LC3（绿色，左侧面板）的Neuro2a细胞被模拟感染(A类)，感染JEV（MOI 5，24小时）(B类)或缺血清12小时(C类). 细胞固定并用JEV-E抗体染色（蓝色，中间板）。右侧面板中显示了两个信号的合并。比例尺：10µm。(**D和E**)量化显示GFP-LC3点状分布的细胞(D类)，以及每个细胞中GFP-LC3点的数量(E类). (F类)在感染后和饥饿后的指定时间，对模拟感染、血清饥饿和JEV感染的Neuro2a细胞进行裂解。用LC3、JEV、NS5（感染控制）和GAPDH（负荷控制）抗体对裂解产物进行免疫印迹分析。(**G公司**)模拟感染、血清饥饿（12 h）或JEV感染（MOI 5，24 h）的Neuro2a细胞中自噬基因的定量PCR（qPCR）。该图显示了与模拟感染样本标准化的基因转录的相对增加表达。数值代表3个独立实验的平均值±SD。(**H和I**)Vero细胞（H）、WT和*第5天^−/−*MEF（I）被模拟感染、血清饥饿（12 h）或JEV感染（MOI 5，24 h）。使用LC3、JEV、NS5和GAPDH抗体进行蛋白质印迹。计算LC3-I/GAPDH和LC3-II/GAPDH的比率，如下所示。学生t吨测试用于计算*P（P）*值**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01.

**图2。**自噬限制JEV的复制并影响病毒产量。(A类)Western blot显示对照组非靶向（NT）和*附件7*siRNA-转染Neuro2a细胞后48小时。ATG7/GAPDH和LC3-I/GAPDH的比率显示在印迹下方。(B类)控制（NT）/*附件7*用JEV（MOI 5）和24 h pi感染siRNA-转染的Neuro2a细胞，用qRT-PCR检测病毒RNA水平。(C类)感染对照细胞和ATG7缺陷细胞培养上清中的JEV滴度。(D类)Western印迹显示WT和*第5天^−/−*MEF公司。(**E和F**)WT和*第5天^−/−*MEF感染JEV（MOI 1）。(E类)在感染后指定时间通过qRT-PCR测定病毒RNA水平。(F类)测定培养上清在24小时pi时的JEV滴度。学生t吨测试用于计算*P（P）*值***P（P）*< 0.01.

**图3。**自噬缺陷细胞极易受到病毒诱导的细胞死亡的影响。(A类)模拟和JEV感染（MOI 5、24和48小时），用DMSO（Ctl）、100 nM巴非霉素A处理Neuro2a细胞₁（Baf）固定前2 h或50µg/ml胃蛋白酶抑制素A（Pep）固定前12 h，蛋白质提取物用LC3、SQSTM1、NS1和GAPDH（负荷控制）抗体进行免疫印迹分析。(B类)48小时pi时JEV感染（MOI 1）对照/ATG7-缺失Neuro2a细胞的死亡率。(**C和D**)WT（黑条）和*第5天^−/−*（散列条）MEF在MOI 0.1感染JEV(C类)和MOI 1(D类)分析24和48h时的细胞死亡率。给出了3个独立实验所得值的平均值±标准误差。学生t吨测试用于计算*P（P）*值**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01.

**图4。**JEV NS1与内源性LC3共定位，但与GFP-LC3不共定位。(**A和B**)JEV感染的Neuro2a细胞（MOI 5，24 h pi）用小鼠NS1（红色）和兔LC3（绿色）染色(A类)或小鼠NS1（红色）和兔LAMP1（绿色）抗体(B类). DAPI染色（蓝色）显示细胞核。(C类)将JEV感染的Neuro2a细胞注射LysoTracker Red脉冲，固定并用NS1抗体（绿色）染色。(D类)转染GFP-LC3（绿色）的Neuro2a细胞感染JEV并用NS1抗体（红色）染色。彩色合并图像显示在第三个面板中。最右边的面板显示了与星号（*）对应的区域的放大视图。比例尺：10µm和3µm（最右侧面板）。(E类)条形图显示了JEV NS1与LC3、LAMP1、LysoTracker Red和GFP-LC3阳性隔间的共定位程度。NS1和内源性LC3之间的Colocalization指数显著高于LAMP1、LysoTracker Red和GFP-LC3。学生t吨测试用于计算*P（P）*值**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01.

**图5。**JEV NS1与WT和*第5天^−/−*MEF公司。(A类)重量和(B类)*第5天^−/−*MEF被模拟或JEV感染（MOI 5，24 h），并用LC3（绿色）和NS1（红色）抗体染色。最右边的面板显示了2个信号和DAPI（蓝色）的合并，用于核染色。比例尺：10µm。

**图6。**JEV NS1定位于EDEM1阳性囊泡。(A类)JEV感染的Neuro2a细胞，以及WT和*第5天^−/−*MEF（MOI 5，24 h）用EDEM1（绿色）和NS1（红色）抗体染色。彩色图像显示在第三个面板中。最右边的面板显示了标有*的区域的放大视图。比例尺：10µm和3µm（最右侧面板）。(B类)NS1与EDEM1在Neuro2a、WT和*第5天^−/−*MEF公司(C类)在不连续的Optiprep梯度上分离JEV感染的Neuro2a细胞的核后上清液。从梯度的顶部到底部收集五个组分，并用LC3、EDEM1、LAMP1、NS1、NS3和NS5抗体进行检测。

**图7。**复制中间体dsRNA与EDEM1囊泡共定位。(A类)JEV感染（MOI 5，24小时）Neuro2a细胞、WT和*第5天^−/−*MEF用EDEM1（绿色）和dsRNA（红色）抗体染色。右侧面板中显示了两个信号的合并。(B类)dsRNA和EDEM1之间的皮尔逊共定位系数。比例尺：10µm。

**图8。**LC3是JEV复制的重要宿主因子。(A类)用对照非靶向（NT）或*Lc3号机组*(*Lc3a公司*和*Lc3b公司*),*选择1*和*水肿1*在转染后48小时对siRNA进行裂解，并用相应的抗体和负载控制GAPDH进行检测。(B类)通过qRT-PCR测定感染JEV（MOI 5，24 h）的siRNA处理的Neuro2a细胞中的病毒RNA水平。(C类)按下述方法处理的细胞培养上清液中的JEV滴度(B类). 学生t吨测试用于计算*P（P）*值**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01.

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[10] GannagéM、Dormann D、Albrecht R、Denggel J、Torossi T、Rämer PC、Lee M、Strowig T、Arrey F、Conenello G等。甲型流感病毒的基质蛋白2阻断自噬体与溶酶体的融合。细胞宿主微生物。2009;6:367–80. doi:10.1016/j.chom.2009.09.005。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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