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.2014年7月18日：5447。
doi:10.1038/ncomms5447。

一种作为流感疫苗佐剂的微杀菌炎症阵列

Ji Wang（音译） 1, 迪利普·沙阿 1, 陈新元 1, 罗克斯·安德森 2, 梅X吴 2
附属公司

一种作为流感疫苗佐剂的微杀菌炎症阵列

Ji Wang（音译）等。 国家公社. .

摘要

皮肤接种迫切需要佐剂。在这里，我们报告说，在接种点诱导的微生物炎症可以增强动物模型中对流感疫苗的免疫反应。接种部位在皮下注射疫苗之前，用手持非烧蚀分光激光器短暂照射，在皮肤中形成一系列自愈性低温区（MTZ）。MTZ中的死亡细胞发出“危险”信号，吸引大量抗原呈递细胞，尤其是围绕每个MTZ形成的浆细胞样树突状细胞（pDC），形成一个微型炎症阵列。pDC在佐剂性中的关键作用是通过系统性耗尽pDC后免疫功能的显著丧失、局部应用TNF-α抑制剂或干扰素调节因子7（IRF7）的无突变来确定的。与引起持续炎症和皮肤损伤的传统佐剂相比，微杀菌炎症可提高流感疫苗的疗效，但副作用较小。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者没有利益冲突需要声明。

数字

图1
图1。NAFL/IMIQ增强ID流感疫苗的免疫原性
用0.06µg（HA含量）H1N1流感疫苗单独免疫BALB/c小鼠（无佐剂），或在NAFL、IMIQ或NAFL/IMIQ佐剂存在的情况下，或用相同剂量（IM）或10倍更高剂量（0.6µg）的疫苗免疫IM小鼠。4周后测量体液免疫反应，包括HAI滴度(一)，IgG(b条)，IgA(c（c）)或IgG2a(d日). 在免疫后4、12、24和36周进一步监测HAI滴度(电子). 水平灰色线表示HAI的标准保护滴度。n=8，NAFL和NAFL/IMIQ组除外（n=10）。(f、 克)细胞介导的免疫反应。免疫一周后分离PBMC，用疫苗和抗CD28抗体刺激PBMC，并分析IFNγ分泌CD8的百分比+(（f）)和CD4+(克)流式细胞术检测T细胞。n=6，NAFL和NAFL/IMIQ组除外（n=8）。(h-j型)挑战性研究。用10×LD对免疫小鼠和非免疫对照小鼠进行鼻内攻击50接种疫苗5周后，感染A/California/7/2009 H1N1病毒。感染后4天对感染小鼠进行安乐死，以通过TCID测定肺部病毒滴度50使用MDCK细胞进行分析(小时). n=6。体重(我)和生存(j个)每天监测14天。NAFL/IMIQ组和NAFL或IMIQ组的体重相对于感染前水平下降的百分比以及存活百分比通过以下方式进行比较：t吨-测试或Logrank测试。n=6，NAFL和NAFL/IMIQ组除外（n=8）。数据以平均值±标准误差表示。除非另有说明，否则ANOVA/Bonferroni对统计显著性进行了分析。*，p<0.05；**，p＜0.01或***，p＜0.001。所有实验重复两次，结果相似。
图2
图2。NAFL/IMIQ与基于角鲨烯的佐剂的比较
BALB/c小鼠单独使用流感疫苗（无佐剂）或在NAFL/IMIQ佐剂存在的情况下进行ID免疫，或使用相同剂量的疫苗与基于角鲨的佐剂（AddaVax）混合进行IM免疫。血清IgG(一)和HAI(b条)在2周内测量水平。n=8。(c（c）)接种部位的H&E染色。在第1天、第3天和第7天采集接种部位的肌肉和皮肤组织，显示了4个类似实验的代表性结果。箭头和黑色虚线表示MTZ的一部分，比例尺，100µm。注：经激光治疗后，角质层（SC）和表皮（Epi）均已就位。用ELISA法在免疫后0、1、4、8、24和48小时测定血清IL-6(d日)每小时监测体温10小时(电子). 所有温度均以非免疫小鼠为标准。n＝4。数据以平均值±标准误差表示。ANOVA/Bonferroni对以下数据的统计显著性进行了分析(一)和(b条)，或t检验(d日)和(电子). *, p<0.05；**，p<0.01或***，p<0.001。除非另有说明，实验重复两次，结果相似。
图3
图3。猪NAFL/IMIQ佐剂研究
对约克郡猪的外后腿进行剃毛、清洁，并只接种100µl流感疫苗（3µg HA含量）（无佐剂）或用Fraxel SR-1500（NAFL）进行一次激光照射，然后将IMIQ应用于免疫部位（NAFL/IMIQ）。或者，单独接种疫苗的免疫接种点直接局部应用IMIQ（IMIQ）。在2周内测量HAI滴度(一). 每个符号代表单个动物的数据，横条表示平均值，碟形线表示HAI的标准保护滴度。n=4。(b条)免疫后第0天、第1天、第3天和第7天拍摄照片，每组4头猪显示代表性结果。比例尺，5 mm(c（c）)免疫接种后3天，通过Image Pro Premier软件分析注射部位的红斑区域。每个符号代表一个注射部位分析3次的平均值。水平条表示平均值。从左到右，n=11、8、8和12。(d日)H&E载玻片显示接种部位的浸润细胞，代表了两个单独实验中的6个类似结果。比例尺，200µm。通过ANOVA/Bonferroni分析统计显著性。*，p<0.05；**，p<0.01或***，p<0.001。
图4
图4。在NAFL/IMIQ存在下加速APC向dLN的迁移
用NAFL或NAFL/IMIQ佐剂的流感疫苗将MHC II-EGFP转基因小鼠ID接种在一只耳朵中。MHC II的积累+免疫后不同时间通过活体共焦显微镜观察单个MTZ周围的APC，免疫后8小时捕获的APC显示为(一)，左侧面板。在接种流感疫苗后的0、3、8和24小时，用NAFL治疗（上面板）或NAFL/IMIQ（下面板）追踪了一个代表性的MTZ(一)，代表了两个单独实验中的6个类似结果。白色虚线圆圈突出显示MTZ。比例尺，200µm。(b条)监测淋巴管内的APC。在免疫后8小时制备耳朵并进行全山免疫组织学染色。通过共焦显微镜观察APC（绿色）、淋巴管（蓝色和/或红色）和血管（红色），代表了两个单独实验中的6个类似结果。比例尺，100µm。通过手动计数GFP确定每个淋巴管内APC的平均数量+在20个随机选择的区域中，淋巴管内的细胞总数超过40个(c（c）)在此期间进行三维扫描以确认每个APC的血管内定位(b条). (d、 e（电子）)CD11的比例+皮肤中的DC(d日)以及每个dLN中DC的总数(电子). CD11c公司+在单独接种流感疫苗或在存在指定佐剂的情况下接种流感疫苗后的指定时间，通过流式细胞术对背部皮肤和dLN中的DC进行定量，如图1所示。n=6，NAFL/IMIQ组除外（n=8）。数据以平均值±标准误差表示。统计显著性通过ANOVA/Bonferroni进行分析。*，p<0.05；**，p<0.01或***，p<0.001。所有实验重复两次，结果相似。
图5
图5。NAFL/IMIQ最好招募pDC
(一)接种点的趋化因子生产。在不同时间的激光治疗后，通过定量实时PCR（qPCR）测量BALB/c小鼠的指示趋化因子水平，将其标准化为GAPDH，并以相对于时间零点的倍数增加表示。每个方块代表4只老鼠的平均值，颜色表示从低（蓝色）到高（红色）的倍数增加。(b条)将pDC招募到接种点。pDC由B220鉴定+CD11b型−PCDA-1型+赖氨酸6C+在单独接种流感疫苗或在有指示佐剂的情况下接种流感疫苗6和24小时后，通过补充图6中所述的流式细胞术测定细胞数和pDC在总皮肤细胞中的百分比。n=4。(c（c）)NAFL/IMIQ治疗24小时后，接种部位也用单抗H特异性抗体（上表）或同种对照抗体（下表）染色。注：Siglec H染色（红色）集中在MTZ（白色碟线）周围。在两个单独的实验中，6个类似样品的代表性结果。细胞核蓝色DAPI染色。比例尺，100µm。插入（英寸）(c（c）)显示一条MTZ（白色碟形线），其中一部分由白色方框勾勒并放大C类. (d日)免疫后6小时接种部位的细胞因子表达。通过qPCR测定所示细胞因子的表达水平，并表示为与未接受佐剂的小鼠相比的倍数增加。每个方块代表4只老鼠的平均数。(e、 （f）)在接种流感疫苗和NAFL/IMIQ的小鼠中，dLN中成熟DC的数量增加。在免疫后的指定时间收集dLN，成熟的DC被鉴定为CD86+CD11c公司+单元格(电子)或CD40+CD11c公司+单元格(（f）). n=6，NAFL/IMIQ组除外（n=8）。(克)pDC缺失对NAFL/IMIQ介导的佐剂性的影响。免疫前24小时和0小时，用400µg抗mPDCA-1抗体或对照抗体（对照）IP注射小鼠。一周后测量细胞免疫反应（中下部面板），两周后测量体液免疫反应（上部面板）。n=8。数据以平均值±标准误差表示。统计显著性通过ANOVA/Bonferroni进行分析。*，p<0.05；**，p<0.01或***，p<0.001。所有实验重复两次，结果相似。
图6
图6。NAFL/IMIQ增强老年小鼠的保护性免疫
用0.6µg（HA含量）H1N1流感疫苗单独或在NAFL、IMIQ或NAFL/IMIQ佐剂存在的情况下对老BALB/c小鼠进行ID免疫。将相同剂量的疫苗与AddaVax佐剂混合用于老年小鼠的IM免疫接种，或在老年（IM）和成年（IM）小鼠中不添加AddaVax（AddaVax:AddaVax2）作为对照。(一)4周后测定HAI抗体滴度。分泌干扰素γ的CD4的百分比+(b条)和CD8+(c（c）)免疫一周后，对疫苗刺激的PBMC中的T细胞进行分析。5周内用5×LD攻击小鼠50小鼠适应的A/California/7/2009 H1N1病毒。体重(d日)和生存(电子)每天监测16天。n=6，NAFL/IMIQ组除外（n=13）。数据以平均值±标准误差表示。统计显著性通过ANOVA/Dunnett’s进行分析，p<0.05；**，p<0.01或***，p<0.001。所有实验重复两次，结果相似。
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