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.2014年7月10日；10（7）：e1004495。
doi:10.1371/journal.pgen.1004495。 eCollection 2014年7月。

磷抑制复合物（PhoRC）向多梳反应元件的有效募集需要组合相互作用

塔吉亚娜·卡恩 1, 佩尔·斯坦伯格 2, 文森佐·皮罗塔 三, 尤里·施瓦茨 1
附属机构

磷抑制复合物（PhoRC）向多梳反应元件的有效募集需要组合相互作用

塔吉亚娜·卡恩等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

多梳群（PcG）蛋白是控制后生动物发育和细胞分化的表观遗传学阻遏物。在果蝇中，PcG蛋白形成五种不同的复合物，通过多梳反应元件（PRE）靶向基因。在所有PcG复合体中，PhoRC是唯一一个包含序列特异性DNA结合亚单位（PHO或PHOL）的复合体，这导致了一个将PhoRC置于招募层级基础的模型。在这里，我们证明体内PHO作为PhoRC的一个亚单位优先于PHOL，并且PHO和PHOL与PRE和转录活性启动子的子集相关。虽然与启动子位点的结合取决于识别序列的质量，但与PRE的结合并不如此。相反，有效招募PhoRC到PRE需要SFMBT亚单位和与Polycomb抑制复合物1的串扰。我们发现人类YY1蛋白（PHO的直系同源物）结合人类基因组中活性启动子的位点，但不结合大多数PcG靶基因，可能是因为靶向果蝇PRE的相互作用在哺乳动物谱系中丢失了。我们得出结论，PhoRC向PRE的招募是基于组合相互作用，并提出当靶基因转录激活时，这种招募策略对于减弱PcG蛋白的结合非常重要。我们的研究结果允许PhoRC在PcG招募层次中的适当位置，并为解释为什么YY1不太可能成为哺乳动物多囊综合体的一般招募者提供了理论依据，尽管据报道YY1具有参与苍蝇PcG抑制的能力。

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数字

图1
图1。与PHOL相比，PHO与SFMBT和PcG抑制的联系更紧密。
A类PHOL（红色）、PHO（蓝色）SFMBT（绿色）和Polycomb（PC，紫色）沿2号染色体左臂分布。最强的PHO和SFMBT位点彼此一致，并与PC一致，而最强的PHOL位点，其中一些用黑色箭头标记，位于PC调节基因之外。B类PHOL、PHO和SFMBT结合位点与PRE的重叠百分比绘制为从数据集中逐渐删除较弱的结合位点。C、。绘制方式如下(B类)PHOL、PHO和SFMBT结合位点与活性TSS周围+/-300 bp区域的重叠百分比。注意，最强的PHO和dSFMBT结合位点位于PRE，而最强的PHOL位点位于活性TSS。PRE（共201）取自。根据Cherbas等人的RNA测序数据和外显子模型（RPKM）每kb 300次读取的阈值，定义了活性TSS（总计7946）。D类在一组TSS近端位点（x轴下方显示）进行PHOL RNAi后，PHOL ChIP信号急剧下降，表明它们代表了一类真正的PHOL结合位点。这个w-pr型扩增子对应于白色基因并作为阴性对照。ChIP产率表示为反应中存在的总输入材料的分数。这里和下面显示了两到三个独立实验的平均值和标准偏差（误差条）。
图2
图2。扩展PHO/PHOL基序的存在与有效的PhoRC与PRE结合无关。
A类扩展PHO/PHOL基序的标志表示源自对前100个最强TSS-近端PHOL位点的分析。注意位置6和10之间的中央保守GCCAT核心。B类序列基序的标志表示丰富了按PHO ChIP-ChIP信号强度排列的前100个计算定义PRE。840个TSS-近端PHOL结合位点(C、 D类)和166个计算定义的PRE，在ChIP-ChIP实验中显示PHO的显著结合(E、 F类)根据PHOL/PHO结合强度将其分为不同的箱子。直方图显示了与扩展PHO/PHOL基序最匹配的序列的平均得分(C、 E）或保守的GCCAT核心序列的平均数量(D、 F类)每个箱子内。晶须表示95%的置信区间。TSS-近端PHOL结合位点较强，具有明显的统计学显著性（Wilcoxon秩和检验）趋势(C类)具有扩展的PHO/PHOL图案。这与PRE相反(E类)这表明PhoRC结合强度与延伸基序的存在之间没有相关性。我们注意到，结合力更强的PRE具有多个GCCAT核心的趋势较弱。
图3
图3。PHO和PHOL竞争与dSFMBT的交互，以高效绑定PRE。
用抗PHO抗体免疫沉淀接受抗PHO或dSFMBT RNAi的细胞的染色质(A类,C类)或PHOL(B类,D类)蛋白质。与模拟RNAi（黑条）相比，在两种RNAi处理（白条）后，PHO与一组选定PRE（在x轴下方显示）的结合减少。相反，PHO后PHOL的结合增加(B类)但不是dSFMBT RNAi(D类). 后者表明，PHOL与PHO竞争与dSFMBT的交互，以更有效地结合PRE。RNAi敲除后PRE的dSFMBT损失程度如所示(E类). PHO（白色条）、PHOL（灰色条）或双（阴影条）RNAi敲除对dSFMBT结合的影响如所示(F类). 在所有面板中，“w-pr型“扩增子，跨越白色基因，作为阴性对照添加。对于这里和下面的所有实验，通过比较用模拟和特异性dsRNA处理的细胞的核提取物中相应蛋白质的水平来衡量RNAi敲除的效率。复制实验中蛋白质消耗的程度基本相同，西区试验的代表性结果如图S2和4A所示。
图4
图4。SFMBT的RNAi敲除并不影响PHO和PHOL的丰度。
答：。将模拟处理细胞和经抗SFMBT dsRNA处理的细胞的核蛋白连续两倍稀释液转移到PVDF膜上，并用指示的抗体进行检测。箭头表示两种SFMBT亚型的位置。B类用核总蛋白SDS-PAGE和考马斯染色控制负荷。左侧显示了分子标准物的重量（单位：kDa）。如western blots所示，RNAi导致SFMBT水平大约降低四倍，但不影响PHOL的总体丰度，并导致PHO水平轻微（～2倍）降低。RT-qPCR分析表明摄影师,福尔(C类)以及本文研究的一组PcG靶基因(D类)也没有改变。在C类和D类显示了两个独立实验的平均值和散布（误差条）。
图5
图5。PRC1的消融破坏PhoRC与PRE的结合。
答：。PhoRC和PRC1之间的串扰模型。我们认为，PHO与其同源识别序列相对较弱的相互作用，结合SFMBT和SCM介导的与PRC1的相互作用（白色代表核心成分），导致PhoRC（黑圈）与PRE的有效结合。PRC1的招募可能依赖于序列特异性DNA结合蛋白，其身份目前未知（虚线白色省略号）。携带纯合子的培养细胞的染色质苏（z）2-1.b8用PSC抗体免疫沉淀缺失（白条）或对照野生型细胞（黑条）(B类)，照片(C类)，电话(D类)和SFMBT(E类). 这里和里面(F类)给出了两个独立实验的平均结果和散布（误差条）。PRE中PSC的完全丢失与大多数PRE中PHO和SFMBT结合的减少平行。PHOL的结合没有显著影响。F、。PHO和SFMBT结合的减少苏（z）2-1.b8通过PRE增强的转录与细胞不平行，PRE保持较低水平，与随机选择的对照基因间区（IR）检测到的转录相当。
图6
图6。在活性状态下，PHO和dSFMBT与PRE的结合显著减少。
电话号码(A类)和dSFMBT(B类)从Sg4（白条）和BG3细胞中的两个独立复制实验中计算出以所选PRE的PHO峰为中心的500 bp区域内的ChIP-ChIP信号（显示在x轴下方）。每个单元格行中PRE的功能状态在每个面板（R）下的表中显示==================================================================压抑；A类==================================================================激活）。当处于活动状态时，所有PRE都显示出明显较低的dSFMBT结合（p==================================================================0.004，Wilcoxon符号秩检验）。八分之七的PRE结合的PHO也显著减少（p==================================================================0.008，Wilcoxon符号秩检验）。一个PRE(瑞士法郎。b)表现出异常行为。当活性时，它结合较少的dSFMBT，但没有显示出PHO信号的减少。对其DNA序列的检查显示存在三个GCCAT核心，但与扩展的PHO/PHOL/YY1识别序列不匹配。可以想象，多个GCCAT核心的有利排列能够创建独立于dSFMBT和PcG阻遏的高亲和力DNA结合平台。
图7
图7。YY1与人类细胞中的多囊沉默无关。
答：。H3K27me3（黑色）、EZH2（红色）、MEL18（绿色）、BMI1（紫色）在NT2-D1细胞中的分布以及YY1在NT2-M1和K562细胞（蓝色）中的分布是沿着12号染色体的26Mb段绘制的。EZH2、MEL18、BMI1和H3K27me3的强结合位点与YY1重合，没有重叠。注意，YY1在NT2-D1和K562细胞中的分布基本相同。B类YY1的范围与NT2-D1细胞中H3K27me3富集区（蓝线）或活性TSS（实线）周围+/-700 bp区域重叠，作为YY1结合信号的函数绘制。YY1和H3K27me3之间几乎没有重叠。MEL18、BMI1和EZH2的重叠区未显示，因为每个箱子的重叠区值为零。活动TSS是根据ENCODE的RNA测序数据和300 RPKM的阈值定义的。C、。通过分析NT2-D1细胞中所有三种抗体检测到的YY1结合位点下的DNA，揭示了序列基序的标志性表示。D类.的表达式年1（黑色条），第二年（白色条），Zfp42型（阴影条）和“内务管理”TBP（待定）来自RNA-seq数据的（灰条）基因表明，YY2和ZFP42蛋白在x轴下方列出的大多数细胞类型中不可用。绘制两个独立实验之间的平均RPKM值，并用误差条表示离散度。
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