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.2014年7月10日；10（7）：e1004217。
doi:10.1371/journal.ppat.1004217。 eCollection 2014年7月。

流感病毒宿主关闭导致抗病毒应激诱导的翻译停滞

拒绝卡巴斯基 1, 穆罕默德·埃马拉 2, 本杰明·约翰斯顿 1, 保罗·安德森 三, 托德·F·哈奇特 1, 克雷格·麦考密克 1
附属公司

流感病毒宿主关闭导致抗病毒应激诱导的翻译停滞

拒绝卡巴斯基等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

流感A病毒（IAV）聚合酶复合物在受感染细胞的细胞核中发挥作用，产生带有5'帽和多聚A尾的mRNA，并被输出到细胞质中，由宿主机器翻译。宿主抗病毒防御包括检测病毒感染应激和阻止cap依赖性mRNA翻译的机制，这通常会导致翻译停滞的mRNA-蛋白复合物（称为应激颗粒（SGs））的细胞质聚集物的形成。目前尚不清楚IAV如何确保优先翻译病毒基因产物，同时避免应激诱导的翻译停滞。在这里，我们证明在感染的早期阶段，病毒和宿主mRNA对药物诱导的翻译停滞和SG形成都很敏感。相比之下，在感染的后期，IAV对应激诱导的翻译停滞具有部分抵抗力，从而维持病毒基因产物的持续翻译。为此，病毒部署了多种阻断应激诱导的SG形成的蛋白质：1）非结构蛋白1（NS1）使抗病毒双链RNA（dsRNA）激活的激酶PKR失活，从而阻止eIF2α磷酸化和SG形成；2） 核蛋白（NP）在不影响eIF2α磷酸化的情况下抑制SG的形成；3） 宿主关闭蛋白聚合酶酸性蛋白X（PA-X）强烈抑制SG的形成，同时细胞质多聚（A）RNA的急剧耗竭和多聚（A）结合蛋白的核积累。具有破坏PA-X宿主关闭功能的重组病毒未能有效抑制应激诱导的SG形成。IAV介导的SG阻断的三种不同机制的存在揭示了病毒复制过程中应激诱导翻译停滞的威胁程度。

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数字

图1
图1。甲型流感病毒通过NS1非依赖性机制在感染后的后期抑制亚砷酸钠诱导的SG形成。
（A和B）。用免疫荧光染色法分析感染野生型（PR8）的A549细胞和感染后18小时用亚砷酸钠（As）处理的NS1突变型甲型流感病毒的SG形成。通过NP（绿色）抗体染色鉴定病毒感染细胞，通过TIA-1（红色）染色观察SG。B组细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺表示20µm。（C） 在感染后6、12、18和24小时（hpi），对感染WT PR8病毒的A549细胞中病毒和亚砷酸盐诱导的SG形成进行量化。（D） 在感染PR8 NS1 N15病毒的细胞中进行与（C）中相同的定量。（E） 比较模拟感染细胞和感染NS1突变的重组PR8病毒的细胞在18 hpi时的SG形成。（F） 模拟和PR8病毒感染的A549细胞的全细胞裂解物的自射线照片。在6或16 hpi时，细胞要么未经处理（-），要么用亚砷酸钠（+As）处理1小时，然后立即用脉冲标记[35S] 蛋氨酸-[35S] 半胱氨酸作用30分钟（G）对亚砷酸盐治疗后6和16 hpi之间的病毒NP和HA转化率进行比较。（F）亚砷酸盐处理后的谱带强度归一化为未经处理的样品谱带强度。
图2
图2。流感病毒对vRNP出口非依赖性SG的抑制与细胞质多（A）RNA的耗竭和PABP1的核重定位相一致。
（A和B）在18 hpi条件下用亚砷酸钠处理模拟和PR8病毒感染细胞的免疫荧光分析。（A） 在6 hpi时，一些A549细胞接受10ng/ml钩端霉素B（+LMB）以阻断病毒核糖核蛋白的核输出，直到亚砷酸盐处理和随后在18 hpi固定。用TIA-1（红色）和YB-1（绿色）标记物染色分析SG的形成，用NP（蓝色）抗体检测病毒核糖核蛋白。（B） 分析U2OS和A549细胞中细胞G3BP、eIF3A（红色）、PABP1（PABP，绿色）和流感病毒蛋白（IAV，蓝色）的SG形成和亚细胞分布。请注意，虽然在U2OS细胞中，大多数IAV抗原在18 hpi时仍为核抗原，但此时A549细胞中的病毒物质从核中输出（开放箭头）。然而，在这两种细胞系中，病毒会导致PABP1重新分布到细胞核，SG的形成被阻断（填充箭头）。（C） 通过荧光原位杂交分析感染后指定时间模拟和PR8病毒感染的A549细胞中多聚（A）RNA的亚细胞分布。在18 hpi时，许多PR8感染细胞的细胞质减少，核多聚A信号增加。在亚砷酸盐处理（+As）后，这些细胞无法形成胞质多（A）RNA应激颗粒（箭头所示）。比例尺===========================================================20微米。
图3
图3。A型流感病毒阻断SG的形成不依赖于诱导刺激和eIF2α磷酸化下游。
通过免疫荧光染色和western blot分析模拟和PR8病毒感染的A549和U2OS细胞在18 hpi时SG的形成和eIF2α的磷酸化。细胞要么未经处理（-），用pateamine A（PatA）处理1小时，用thapsigargin（Tg）处理1小时，要么在分析前暴露于紫外线并孵育2小时（UV）。（A） 用甲型流感病毒抗体（IAV，红色）和TIAR抗体（红色）进行免疫荧光染色。比例尺===========================================================20微米。（B） SG的形成是根据（A）中的实验进行量化的。（C） 按（A）处理的A549和U2OS细胞的全细胞裂解物的Western blot分析。
图4
图4。甲型流感病毒PA和NP ORF的异位表达抑制亚砷酸盐和帕特胺A诱导的SG形成。
HeLa-TetOff细胞被转染带有c-末端myc标记的IAV ORF或EGFP或mRFP表达载体的表达载体，并在转染24小时后用亚砷酸钠或PatA处理。通过TIA-1或TIAR免疫荧光染色分析治疗后50分钟SG的形成，通过myc表位染色分析病毒ORF编码蛋白的SG共定位。（A） ●●●●。从3个独立实验中量化了砷化物诱导的SG形成（深灰色条）和SG补充（双阳性SG，浅灰色条覆盖）。（B） ●●●●。具有代表性的免疫荧光图像显示了亚砷酸盐通过PA-myc和NP-myc诱导的SG抑制（箭头所示），M1-myc蛋白和NS1-myc蛋白的SG共定位（圆圈），以及PA-mcy表达细胞中PABP1核重定位。（C） ●●●●。从2个独立实验中定量表达指示的IAV ORF和对照mRFP蛋白的细胞中PatA诱导的SG形成（深灰色条）和SG募集（双阳性SG，浅灰色条覆盖）。（D） ●●●●。代表性免疫荧光图像显示PA-myc和NP-myc对PatA治疗的SG抑制作用（箭头），以及NS1-myc蛋白的SG共同定位（圆圈）。
图5
图5。SG抑制需要NP齐聚。
（A和B）。HeLa-TetOff细胞转染所示野生型和突变型NP蛋白的表达载体，转染24小时后用亚砷酸钠处理。通过免疫荧光染色（A）和定量（B）分析治疗后50分钟NP结构（绿色）和SG形成（TIAR，红色）的亚细胞分布。（C） ●●●●。NP蛋白的示意图，显示了本研究中突变氨基酸的选定初级序列特征（色差）和位置。与N末端核定位信号（NLS1）不同，下游NLS（NLS2）被认为在折叠蛋白中没有功能。细胞质积累序列（CAS）含有参与低聚的残基。
图6
图6。病毒PA-X蛋白通过消耗宿主细胞质mRNA参与SG抑制。
用所示表达载体转染（A，B，D）HeLa-TetOff细胞，转染24小时后用亚砷酸钠处理。（A） 通过荧光原位杂交（绿色）分析聚（A）RNA的亚细胞分布。通过随后的myc表位（红色）免疫荧光染色检测全长野生型和突变型PA结构的表达。（B） 免疫荧光染色分析SG的形成（TIA-1，红色）和PABP1的亚细胞分布（PABP，绿色）。（D） SG的形成是根据（A）中描述的实验进行量化的。（C和E）亚砷酸钠处理的模拟、野生型（PR8）和重组PA-X缺陷型（PR8PA（fs）病毒感染的A549细胞的免疫荧光分析表明，PA-X表达是PABP1核重定域和有效SG抑制（18hpi）所必需的。（C） 有代表性的图像显示，野生型细胞中SG受到强烈抑制，PABP1核重定域，但18 hpi亚砷酸钠处理的PR8 PA（fs）突变病毒感染细胞中没有。（E） ●●●●。从（C）量化SG形成和核PABP1定位。（F） ●●●●。由相同片段3转录物合成的PA和PA-X蛋白的示意图，共享包含核酸内切酶结构域的前191个氨基酸。持续的ORF翻译（第0帧，绿色）产生全长病毒聚合酶亚基PA，而F191密码子的+1移码（第+1帧，红色）产生较小的PA-X蛋白。图中显示了PA和PA-X内切酶活性所需的D108残基的位置。右侧是本研究中突变的移码位点序列。注意，PA-X结构中的单核苷酸缺失完全阻止了全长PA蛋白的表达，如面板右栏（A）中缺少myc-tag检测所示。
图7
图7。Pateamine A治疗导致病毒蛋白和基因组RNA合成持续停滞。
（A） ●●●●。亚砷酸盐和帕特胺A处理1小时对IAV蛋白积累的影响。A549细胞感染PR8病毒，并在4hpi条件下用亚砷酸盐或帕特胺A处理。1小时后，取出含药物的培养基，用PBS清洗细胞，并接受新鲜培养基。在18和24 hpi时收集全细胞裂解物，并用western blot进行分析。（B和C）模拟和PR8病毒感染细胞裂解物的放射自显影图。在3 hpi时，细胞未经处理（-）或用亚砷酸钠（B）或帕特胺A（C）处理1小时，然后用[35S] 蛋氨酸-[35S] 治疗后立即按指示的2小时间隔服用半胱氨酸。（D） 从（B）和（C）中的放射自显影图中量化亚砷酸盐和帕特胺A治疗后病毒蛋白翻译的恢复。每个时间点，处理后通道的谱带强度均归一化为未经处理的样本谱带强度。（E到H）。在模拟和PR8病毒感染的A549细胞中，在4hpi条件下用10nM的帕特胺A处理，分析SG的形成、病毒RNA的积累和感染病毒的产生。（E） 通过菌斑试验分析24 hpi时收集的培养基中的病毒滴度。（F） 在感染后指定时间（hpi）固定细胞并免疫荧光染色以检测NP流感（红色）和TIAR流感（绿色）。（G） 实时定量RT-PCR定量病毒基因组RNA片段8的积累。（H） 通过实时定量RT-PCR定量病毒NS1 mRNA的积累。（一） Pateamine A保护细胞免受流感病毒诱导的细胞死亡。Vero细胞在MOI 0.1下接种PR8病毒。1小时后，用含有2.5µg/ml胰蛋白酶和指定浓度的髌胺A的感染培养基或缺乏胰蛋白酶的对照培养基（无胰蛋白酶）代替接种物。感染后2天用4%多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫（紫色）染色。
图8
图8。NS1、NP和PA-X蛋白协同作用抑制甲型流感病毒感染细胞中翻译停滞和SG形成的模型。
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