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.2014年7月8日8:3:e03191。
doi:10.7554/eLife.03191。

金属转运蛋白ZIP13为黑腹果蝇的分泌途径提供铁

附属公司

金属转运蛋白ZIP13为黑腹果蝇的分泌途径提供铁

萧桂然等。 埃利夫. .

摘要

细胞内铁转运过程尚不清楚,负责铁转运到分泌室的铁转运蛋白的身份仍不清楚。在这项研究中,我们发现果蝇ZIP13(Slc39a13),一个假定的锌输入者,完成了铁流出的作用。干扰dZIP13的表达会导致铁可回收的铁吸收缺陷,同时胞质溶胶中的铁增加和分泌区室中的铁减少,铁蛋白铁负荷失败,以及胶原分泌异常。dZIP13在大肠杆菌中的表达赋予宿主铁依赖性生长和铁抗性。重要的是,使用铁同位素的时间推移转运分析表明dZIP13具有强大的铁输出活性。dZIP13作为一种铁转运蛋白的鉴定表明,埃勒斯-丹洛斯综合征的脊椎骨发育异常形式,其中hZIP13有缺陷,可能是由于铁输送到分泌室失败所致。我们的结果也拓宽了我们对铁平衡失调缺陷范围的认识。

关键词:果蝇;埃勒-丹洛斯综合征;Slc39a13段;铁转运车;分泌室。

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利益冲突声明

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数字

图1。
图1.果蝇ZIP13的序列分析。
(A类)果蝇ZIP13蛋白(dZIP13,顶部)、人类ZIP13(hZIP13)和人类ZIP4(hZIP4,底部)蛋白质的比对。从GenBank获得hZIP13、hZIP4和dZIP13(CG7816)的氨基酸序列,并通过HMHMM软件进行了比对。黑色和粉红色阴影分别表示相同和保守的氨基酸。八个假定的跨膜(TM)区域下划线,表示为“TM I”至“TM VIII”。(B类)人类和果蝇ZIP家族成员的系统发生树分析。该树是使用ClustalX版本1.81生成的,并用TreeView显示。主要集群的引导概率以百分比表示。列出了用于路线的其他果蝇ZIP的接入号码。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.003
图2。
图2。。dZIP13-RNAi苍蝇表现出铁可挽救的缺陷。
(A类)调节dZIP13表达时的体内金属含量。显示的是经过调制的苍蝇数字邮政编码13中肠的表达(NP3084型作为Gal 4驾驶员)。观察到全身铁含量显著下降,但锌或铜含量没有下降dZIP13-RNAi苍蝇,而数字邮政编码13过度表达导致铁增加。数值代表三个独立的测量值,并归一化为干体重;数据以平均值表示+扫描电镜;n个=3或6。*p<0.05**p<0.01;双尾学生的t吨测试。(B类)普遍受干扰的RNA的羽化率-数字邮政编码13(Da>dZIP13-RNA干扰)仔鱼可以通过膳食补铁来挽救。Da-Gal4公司被杂交成野生型或数字邮政编码13-RNA干扰放在果汁杯上的苍蝇。将刚孵出的后代转移到正常食物或添加氯化锌的食物中2、TEPN、FAC或BPS。计算了与成虫接触的苍蝇百分比;n个=6或8。(C类)对照组显示,在食物中补充相同数量的锌、铁或螯合剂对野生型果蝇的羽化率没有影响。(D类)缩短的寿命Da>dZIP13-RNA干扰成年人部分通过膳食补充铁而非锌来解救。计算了与成虫接触的苍蝇百分比;n个= 5.内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.004
图2——图补充1。
图2-图补充1..RT-PCR分析数字邮政编码13击倒或过度表达。
RT-PCR分析数字邮政编码13三龄幼虫的mRNA丰度。第49页用作加载控制。Da-GAL4公司用作表达式驱动程序。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.005
图2——图补充2。
图2-补充图2……免疫印迹分析数字邮政编码13击倒或过度表达。
Western blot显示,本研究中使用的RNAi将dZIP13蛋白抑制到显著降低的水平。采用Tubulin作为负荷控制。Da-GAL4公司用作表达式驱动程序。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.006
图3。
图3。。数字邮政编码13敲除导致体内缺铁,但不会导致肠道细胞的胞浆。
(A类)肠中细胞溶胶乌头酸酶活性增加NP3084型>数字邮政编码13-RNA干扰幼虫和减少NP3084型>dZIP13-OE型幼虫,分别表明细胞质中铁升高和缺铁。面板(b)是(a)的定量测量。结果显示为平均值+SEM相对活性;n个= 3.*p<0.05**p<0.01***p<0.001;双尾学生的t吨测试。(B类)除肠道外(肠道以外的身体部位)NP3084型>数字邮政编码13-RNA干扰幼虫和增加NP3084型>dZIP13-OE型幼虫。面板(b)是(a)的定量测量。结果显示为平均值+SEM相对活性;n个= 3.*p<0.05**p<0.01***p<0.001;双尾学生的t吨测试。(C类)RT-PCR分析正常苍蝇对铁变化(用铁或螯合剂喂养)的铁稳态基因。RNA是从三龄幼虫中肠中提取的。第49页用作加载控制。(D类)dZIP13 RNAi或OE三龄幼虫中肠铁稳态基因的RT-PCR分析。表达由中肠驱动因素驱动NP3084型. (E类)当dZIP13表达受到调节时,对肠道中金属含量的分析。显示的是经过调制的苍蝇幼虫的金属含量数字邮政编码13中肠的表达(NP3084型作为Gal 4驾驶员)。dZIP13-RNAi苍蝇;数字邮政编码13过度表达导致铁增加。结果显示为平均值+SEM相对活性;n个= 3.*p<0.05**p<0.01***p<0.001;双尾学生的t吨测试。(F类)当dZIP13在幼虫中肠中的表达受到调控时,全身体小肠部分的金属含量分析(NP3084型作为Gal 4驾驶员)。观察到全身微量肠道铁(而不是锌或铜)显著减少dZIP13-RNAi苍蝇;数字邮政编码13过度表达导致铁增加。结果显示为平均值+SEM相对活性;n个= 3.*p<0.05**p<0.01***p<0.001;双尾学生的t吨测试。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.007
图4。
图4。。数字邮政编码13敲低导致肠道中铁蛋白铁负荷减少。
(A类)幼虫肠道中的铁染色。中肠收缩染色和中肠前部异位铁染色分别用箭头(蓝色)和箭头(绿色)表示。中肠前部NP3084>dZIP13-OE苍蝇幼虫的铁沉积量明显高于对照。铁在NP3084>dZIP13-OE虽然NP3084型>数字邮政编码13-RNA干扰成虫几乎没有铁染色。显示的是具有代表性的图像以及亮场和暗场。更多图像显示在图4的补充图1中。(B类)铁质幼虫中肠前部的铁染色。中肠前部紧随前面明显的前胃(pv,红色箭头)。(C类)天然PAGE上的铁(结合铁蛋白)染色。来自对照组和NP3084型>数字邮政编码13-RNA干扰NP3084型>dZIP13-OE型幼虫肠道装载。凝胶直接用普鲁士蓝染色液染色。关于完整的凝胶图像,请参见图4补充图2。面板(b)是(a)的定量测量。n=3。*p<0.05***p<0.001;双尾学生的t吨测试。(D类)肠道铁蛋白表达。肠道中铁蛋白的表达量明显较高NP3084>dZIP13-RAi幼虫。铁蛋白的表达用蛋白陷阱线表示Fer1HCH公司G188号通过N末端GFP融合标记内源性Fer1HCH。图4显示了具有代表性的结果,更多图像显示在图补充3中。(E类)铁蛋白免疫印迹NP3084>dZIP13-RNA我和NP3084型>数字邮政编码13-运行经验幼虫。使用抗铁蛋白轻链抗体。Tubulin被用作负荷控制。关于完整的凝胶图像,请参见图4补充图4。面板(b)是(a)的定量测量。n=3***p<0.001;双尾学生的t吨测试。(F类)dZIP13对铁蛋白RNAi的Eclosion拯救作用。肠特异性羽化率(NP3084型)铁蛋白-RNAi苍蝇被救出的比例从<5%到~30%数字邮政编码13过度表达。将刚孵出的子代转移到正常食物中,并计算与成虫接触的苍蝇百分比。n个= 6. ***p<0.001;双尾学生的t吨测试。(G公司)用dZIP13拯救铁蛋白-RNAi的缺铁。肠道特异性铁蛋白敲除仔鱼体内铁含量的降低也部分被以下因素所挽救数字邮政编码13过度表达。n个= 6. **p<0.01;双尾学生的t吨测试。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.008
图4——图补充1。
图4补充图1。幼虫肠道中的铁染色。
中肠收缩处的铁染色和中肠前部的异位铁染色分别用箭头(蓝色)和箭头(绿色)表示。中肠前部NP3084>dZIP13-OE苍蝇幼虫沉积的铁含量明显高于对照。铁在NP3084>dZIP13-OE虽然NP3084型>数字邮政编码13-RNA干扰幼虫几乎没有铁染色。(A类), (B类)和(C类)是三个独立实验的结果。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.009
图4——图补充2。
图4:补充图2。天然PAGE上的铁(结合铁蛋白)染色。
从对照组和NP3084型>数字邮政编码13-RNA干扰NP3084型>dZIP13-OE型幼虫肠道被装载。凝胶用普鲁士蓝染色液染色。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.010
图4——补充图3。
图4:补充图3。在NP3084>dZIP13-RNAi苍蝇幼虫的肠道中检测到大量铁蛋白。
铁蛋白的表达用蛋白陷阱线表示Fer1HCH公司G188号表达N-末端GFP标记的Fer1HCH蛋白。所示为明亮和黑暗领域的图像。(A类)和(B类)是两个独立实验的结果。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.011
图4——补充图4。
图4-图补充4.的铁蛋白的蛋白质印迹NP3084>dZIP13-RNA我和NP3084>dZIP13-运行经验幼虫。
使用抗铁蛋白轻链抗体。采用Tubulin作为负荷控制。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.012
图5。
图5..dZIP13位于ER/Golgi并参与其铁调节。
(A类)dZIP13在Caco2细胞中的定位。用myc抗体检测dZIP13-myc。免疫荧光染色显示,dZIP13在Caco2细胞中与ER/Glgi部分共定位。(B类)dZIP13在果蝇中肠上皮细胞中的定位。dZIP13抗体直接检测到dZIP15。这些图像表明dZIP13在果蝇肠道细胞中与ER/Glgi部分共定位。(C类)dZip13不能很好地与内体标记物共同定位。显示了果蝇中肠上皮细胞中dZIP13和内体的定位。dZIP13抗体直接检测。溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)与GFP融合用于指示溶酶体和晚期内体;FYVE用于标记早期内体。(D类)ER/Golgi中的铁含量较少dZIP13-RNAi幼虫和更多dZIP13-OE型幼虫。铜没有受到影响,而锌含量略有不同。n个= 3.*p<0.05***p<0.001;双尾学生t吨测试。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.013
图6。
图6异源dZIP13表达呈现大肠杆菌铁依赖性和耐铁性。
(A类)大肠杆菌表达dZIP13需要添加铁才能生长,并且对铁过量更具抵抗力。(B类)检测到的铁含量较少大肠杆菌表达dZIP13而锌和铜没有太大影响。n个=3***p<0.001;双尾学生的t吨测试。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.014
图7。
图7:铁放射性同位素运输表明dZIP13是一个铁出口国。
(A类)表达dZIP13的铁释放的时间过程大肠杆菌细胞。中的dZIP13表达式大肠杆菌与载体控制相比,铁流出率显著增加。(B类)不荧光大肠杆菌表达dZIP13表明,至少有一些dZIP15位于细胞膜上大肠杆菌. (C类)NADPH-细胞色素c还原酶活性测定表明,ER–高尔基制剂确实富含大量ER/高尔基。(D类)内质网/高尔基体样品铁吸收的时间过程。铁吸收率在dZIP13-OE型和更低的dZIP13-RNAiER/Galgi样本。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.015
图7——图补充1。
图7补充图1。Western blot显示纯化的ER/Glgi样品同时含有ER和Golgi。
分别用抗GM130和抗PDI抗体检测高尔基体和ER。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.016
图7——图补充2。
图7补充图2.从果蝇分离的ER/Glgi样品的纯度。
(A类)细胞色素c氧化酶分析表明,纯化后的样品中仍含有一些残留的线粒体部分。(B类)β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(NAG)活性测定表明,样品基本上没有溶胞体污染。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.017
图8。
图8..dZIP13在功能上与hZIP13类似。
(A类)dZIP13或hZIP13过度表达后,乌头糖酶活性降低,但与锌转运蛋白hZIP7无密切关系。n个= 6. **p<0.01;双尾学生的t吨测试。(B类)羽化缺陷数字邮政编码13-RNA干扰苍蝇可以通过hZIP13地址表达式。埃克西翁被救出了约40%至约75%hZIP13地址.n个= 6.*p<0.05**p<0.01;双尾学生的t吨测试。(C类)缩短的寿命数字邮政编码13-RNA干扰也被救出hZIP13地址. (D类)数字邮政编码13-RNA干扰苍蝇表现出铁溶性胶原缺陷。显示了VkgG454/+对照幼虫和dZIP13-RNAi幼虫,在正常食物和含有10 mM FAC的食物中培养。绿色:Vkg-GFP,蓝色:DAPI。(E类)赖氨酰羟基化反应。反应取决于亚铁的存在。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.018
图9。
图9:其他ZIP的第四跨膜结构域中的两个保守氨基酸D和H在ZIP13中切换。
这里显示了ZIP13和其他几个ZIP的第四个跨膜结构域和相邻序列。1-3是来自不同生物体的ZIP13序列。4-6是其他几个具有代表性的ZIP。预测的TM4段下划线。突出显示的两个氨基酸D和H在所有其他密切相关的ZIP中保守,而它们的位置在ZIP13中切换。括号中的数字表示所示ZIP的起始/结束位置。1.邮政编码13(达尼奥雷里奥); 2.邮政编码13(CG7816)(黑腹果蝇); 3.邮政编码13(智人); 4.邮政编码7(智人s) ;5.邮政编码8(智人); 6.拉链14(智人).内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.03191.019
作者回复图片1。
作者回复图片1。
对dZIP13-EGFP幼虫提取物进行EGFP的Western blot,以评估EGFP融合蛋白的稳定性。使用抗-GFP抗体。GFP通道是从Da>GFP苍蝇(4ug)中提取的。控制通道为正常飞行样本(无EGFP表达)(80ug)。dZIP13-EGFP样品(80ug)中检测到少量游离EGFP。低于dZIP13-EGFP的额外频带可能是背景信号,因为它也在正常飞行样本(控制通道)中检测到。

中的注释

  • 泵铁。
    Philpott CC公司。 Philpott CC公司。 埃利夫。2014年8月15日;3:e03997。doi:10.7554/eLife.03997。 埃利夫。2014 PMID:25128012 免费PMC文章。

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