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.2014年8月22日；289(34):23389-402.
doi:10.1074/jbc。M114.573071。 Epub 2014年7月7日。

DNAX-活化蛋白10（DAP10）膜适配器与晚期糖基化终产物受体（RAGE）相关并调节人角质形成细胞中RAGE触发的信号通路

坂口正彦 1, 村田仁 2, 青山由美 三, 东野俊彦 4, 恩迪·维迪亚·普特兰托 2, 我做了Winarsa Ruma 2, 井上优介 5, 酒口良彦 6, 山本贤一 2, 里·基诺西塔 7, 富田纯一郎 7, Ken Kataoka先生 8, 岩崎庆二 三, 南浩嗯 2
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DNAX激活蛋白10（DAP10）膜接头与晚期糖基化终产物受体（RAGE）结合，并调节人类角质形成细胞中RAGE触发的信号通路

坂口正彦等。 生物化学杂志. .

摘要

晚期糖基化终产物受体（RAGE）参与许多炎症、变性和过度增殖疾病的发病机制，包括癌症。此前，我们揭示了配体激活的RAGE的下游信号机制，RAGE招募TIRAP/MyD88。在这里，我们发现DNAX-激活蛋白10（DAP10），一种跨膜适配器蛋白，也与RAGE结合。通过RAGE单独或RAGE-DAP10的人工齐聚，我们发现RAGE-DAP10异二聚体的形成导致Akt活化的显著增强，而RAGE的同多聚体相互作用导致caspase 8活化。正常人表皮角质形成细胞在纳米摩尔浓度下暴露于RAGE配体S100A8/A9，模拟了RAGE-DAP10相互作用的促生存反应，尽管在微米摩尔浓度下，这些细胞模拟了RAGE的促凋亡反应。在转化的上皮细胞系中，内源性DAP10过度表达的A431和HaCaT，以及即使在微摩尔浓度下的S100A8/A9，由于RAGE-DAP10相互作用导致细胞生长和存活。DAP10在细胞系中的功能阻断消除了S100A8/A9激活的RAGE的Akt磷酸化，最终导致细胞凋亡增加。最后，S100A8/A9、RAGE和DAP10在银屑病表皮过度表达。我们的研究结果表明，RAGE和DAP10之间的功能性相互作用协同调节S100A8/A9介导的角质形成细胞的存活和/或凋亡反应。

关键词：癌症；细胞生物学；角质细胞；银屑病；晚期糖基化终产物受体（RAGE）。

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数字

图1。
图1。
DAP10与RAGE的关联。 A、，筛选与RAGE相互作用的受体。HEK293T细胞与RAGE共转染(满的，全长）-3×HA-His6以及标记有3×HA-His的候选基因（TLR4、TNFR1、TNFR2、DAP10、γc和gp130）6.转染24小时后，制备细胞提取物，并通过Western blotting对表达RAGE的抗HA标记珠进行分析。B、，RAGE-DAP10相互作用的确认分析，包括阳性结合对照NKG2D-DAP10。共转染实验如A类使用组合：DAP10–3×FLAG-His6带有膜蛋白(最大功率：TLR4、RAGE和NKG2D）标记有3×HA-His6.C、，DAP10与RAGE的NKG2D非依赖性结合。共转染和IP分析按A类和B类使用RAGE的组合(满的)-3×HA-His6膜蛋白（DAP10和NKG2D）标记有3×FLAG-His6。D、，确定RAGE与DAP10关联的不可或缺的区域。全长(满的)RAGE及其七个碎片(RAGE-Fs公司)贴上Myc-HA-FLAG-His标签6与DAP10–3×FLAG-His共转染6进入HEK293T细胞。细胞提取物的制备和随后的IP实验是在与A、 B、，和C.E（成本效益），DAP10-RAGE下游适配器的识别。RAGE的同时转染(满的)-3×HA-His6和DAP10–3×FLAG-His6带SH2域适配器(SH2DA公司：PI3K-p85、GRB2、GRB7、NCK1、NCK2、CRK、SOCS、SHC和SHP2）标记有3×Myc-His6已执行。转染24小时后，制备细胞提取物，并通过Western印迹对表达的RAGE使用抗HA标签珠在有和没有先前IP的情况下进行分析。F、，适配器（PI3K-p85、GRB2和GRB7）与RAGE-DAP10受体复合体的DAP10依赖性相互作用。RAGE的同时转染(满的)-3×HA-His6，DAP10–3×旗-他的6和一个SH2DA（PI3K-p85、GRB2和GRB7）-3×HA-His6然后在与E类含有非磷酸化DAP10（Y86F是酪氨酸86被苯丙氨酸取代）。Y86F取消下游衔接蛋白的补充。G、，RAGE、DAP10和衔接蛋白之间相互作用的示意图。
图2。
图2。
存在或不存在DAP10关联的RAGE差异信号转导。 A、，均聚过程的示意图((愤怒)M（M）) (顶部)和同二聚体((愤怒)2) (中间的)RAGE细胞和异二聚体(RAGE-DAP公司)RAGE-cyt和DAP10-cyt(底部).B、，有或无DAP10参与的差异衔接蛋白的招募。用DmrB-DmrB-RAGE-cyt-3×HA-His转染HEK293T细胞6独自一人((A类)顶部)，DmrA-DmrB-RAGE-cyt-3×HA-His6和DmrC-DmrB-RAGE-cyt-3×FLAG-His6((A类)中间的)，或DmrA-DmrB-RAGE-cyt-3×HA-His6和DmrC-DmrB-DAP10-cyt-3×FLAG-His6((A类)底部). 转染24小时后，用偶联剂处理或不处理细胞（50 n米，1 h）（B/B同二聚体或A/C异二聚体），并对表达的DmrB-DmrB-RAGE-cyt或DmrA-DmrB-RAGE-cyst使用抗HA标记珠进行Western blot分析。P（P）-，磷酸化。C、，下游分子的差异活化，包括或不包括DAP10B类.Ser-473和Thr-308，在残基处磷酸化Akt；第八类半胱氨酸蛋白酶抑制剂裂解半胱天冬酶8；绑定，激活表单。条形图与微管蛋白相关的磷酸化Akt和裂解caspase 8的定量水平。ImageJ（rsb.info.nih.gov）用于比较Western blots的带密度。D、，用指定的siRNAs（100 n）处理NHK中磷酸化激酶的筛选米，48小时），然后使用磷酸化-MAPK阵列（研发系统）暴露于GST或S100A8/A9（100 ng/ml，24小时）。E、，siRNA对由NHK中的S100A8/A9（100ng/ml）诱导的Akt激活的影响的时间过程实验。条形图与微管蛋白相关的磷酸化Akt和裂解caspase 8的定量水平。
图3。
图3。
siRNAs对S100A8/A9介导的Akt激活的影响。 A、，siRNA对DAP10和RAGE的抑制作用。转染阴性对照siRNA 72小时后(控制)、DAP10 siRNA和RAGE siRNA，每个在100 n时米收集处理后的细胞并进行Western blot分析。B、，siRNAs对S100A8/A9（100 ng/ml）在NHKs、HaCaT和A451细胞中诱导的Akt激活的影响的时间进程实验。转染指定的siRNA 48小时后(控制，DAP10，和愤怒)在NHK中，用S100A8/A9（100 ng/ml）处理细胞，持续指定的时间。
图4。
图4。
S100A8/A9触发的信号在NHKs、HaCaT细胞和A431细胞中受到差异调节。 A、，Akt和裂解半胱天冬酶8的时间依赖性激活(Cl.案例8)S100A8/A9低剂量，100 ng/ml，或(B类)高剂量，10μg/ml.H2O（运行）2(500 μ米3h）作为阳性对照。条形图与微管蛋白相关的磷酸化Akt和裂解caspase 8的定量水平。C、，S100A8/A9激活适配器和下游信号蛋白。应用S100A8/A9（0、0.1和10μg/ml）24小时后，使用生物素化抗RAGE和链霉亲和素珠，通过Western blotting分析细胞提取物，包括有无内源性RAGE的预先IP。D、，不同细胞系（NHKs、HaCaT细胞和A431细胞）之间高浓度S100A8/A9（10μg/ml）激活适配器和下游信号蛋白。
图5。
图5。
NHKs、HaCaT细胞和A431细胞对S100A8/A9的不同反应。 A、，S100A8/A9刺激DNA合成。细胞（NHK(左边)，HaCaT细胞(中间的)和A431电池(正确的))用S100A8/A9（0、0.1和10μg/ml）处理24小时[三H] 在存在或不存在Akt抑制剂（10μ米) (*,第页< 0.05).B、，S100A8/A9诱导细胞凋亡（24小时）。在细胞荧光计数（*，第页< 0.05).C、，裂解半胱天冬酶8的激活(Cl.案例8)通过S100A8/A9（24小时）。实验如所示B类和C类在与A类.
图6。
图6。
DAP10的下调调节RAGE触发的信号。 A、，与NHK相比，内源性DAP10在HaCaT和A431细胞中的表达增加。细胞在有或无补充剂的情况下培养（HKGS用于NHK，FBS用于HaCaT和A431细胞）。通过蛋白质印迹分析测定内源性DAP10的表达水平。B、，在HaCaT和A431细胞中下调DAP10后激活适配器和下游信号分子。100 n转染后48小时米siRNAs，细胞以10μg/ml的浓度与GST或S100A8/A9进一步孵育24 h。然后，制备细胞提取物，并使用生物素化抗RAGE和链霉亲和素珠，通过Western blotting分析是否存在内源性RAGE的预先IP。条形图与微管蛋白相关的磷酸化Akt和Cl.Casp8的定量水平。
图7。
图7。
DAP10相关细胞存活。 A、，HaCaT和A431细胞对10μg/ml S100A8/A9的敏感性通过下调DAP10（*，第页< 0.05). 细胞（HaCaT细胞(左边)和A431电池(正确的))用siRNA处理48小时，并用FITC-标记的膜联蛋白V测定凋亡率。B、，DAP10的强制表达对S100A8/A9介导的凋亡细胞死亡的影响。用表达红色荧光蛋白的质粒瞬时转染NHK(招标书; 阴性对照）或标记有C端子3×FLAG-His的DAP106培养48h后，用S100A8/A9（10μg/ml）处理细胞24h，然后用4%多聚甲醛固定。样品玻片用点击式TUNEL Alexa荧光成像试剂盒（分子探针Invitrogen）处理，以检测凋亡细胞(绿色). 用抗FLAG抗体间接免疫染色观察DAP10的表达(红色). 细胞核用Hoechst 33342染色(蓝色).比例尺，20微米。
图8。
图8。
银屑病皮损表皮中DAP10的高表达。 A、，RAGE配体S100A8/A9异二聚体的免疫组织化学分析(红色)银屑病皮损。寻常型和脓疱型银屑病的角质形成细胞和浸润性炎症细胞中均检测到S100A8/A9。B、，RAGE检测(红色)，DAP10(绿色)和磷酸化Akt(红色)在从正常皮肤和银屑病皮肤制备的皮肤切片中。细胞核用SYBR Green染色。酒吧在里面A类和B类，100微米。C、，IL-22对NHK诱导DAP10 24小时。
图9。
图9。
IL-22对S100A8/A9介导的凋亡细胞死亡的影响。 A类和B类NHK中DAP10和RAGE的表达水平。在应用S100A8/A9、EGF、TGF-β、TNF-α、IL-17和IL-22 24小时后，用Western blot分析检测处理的细胞提取物。B、，低浓度（0.1–1.0 ng/ml）IL-22对NHK中DAP10表达的影响。C类，IL-22对S100A8/A9介导的NHK细胞凋亡的保护作用。在有无IL-22（10 ng/ml）的情况下，用S100A8/A9（10μg/ml）处理细胞24小时。在细胞荧光计数前1小时，向培养物中添加FITC-标记的膜联蛋白V（*，第页< 0.05).
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