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.2014年10月1日；394(1):142-55.
doi:10.1016/j.ydbio.2014.06.023。 Epub 2014年7月2日。

抑制RHO-ROCK信号通过激活小鼠胚泡中的河马信号增强ICM并抑制TE特性

卡纳科·科诺 1, 达娜·安·塔马西罗 1, Vernadeth B Alarcon公司 2
附属公司

抑制RHO-ROCK信号通过激活小鼠胚泡中的河马信号增强ICM并抑制TE特性

卡纳科·科诺等。 求文献一篇. .

摘要

小鼠胚泡中滋养层（TE）和内细胞团（ICM）谱系的规格与细胞位置相关，因为TE来自外细胞，而ICM来自内细胞。位置上的差异反映在细胞极化和河马信号。只有在外细胞中，才建立了顶端-基底细胞极性，Hippo信号被抑制，从而阻止LATS1和2（LATS1/2）激酶磷酸化YAP，YAP是TE特异性基因Cdx2的关键转录共激活物。然而，调节这些事件的分子机制尚未完全了解。在这里，我们发现RHO-ROCK信号的抑制通过激活Hippo信号和破坏顶端基底极性来增强ICM并抑制TE特征。经ROCK抑制剂Y-27632处理的胚胎在囊胚期表现出ICM标记NANOG的高表达和CDX2的低表达。Y-27632处理的胚胎未能在细胞核中积累YAP，尽管它被LATS1/2的伴随抑制所挽救。Y-27632处理抑制了顶端和基底极性调节因子（即PARD6B、PRKCZ、SCRIB和LLGL1）之间的分离，而晚期8细胞期的一些极化事件，如p-ERM和酪氨酸化微管蛋白的致密化和顶端定位正常发生。在接受RHO GTPases抑制剂治疗的胚胎中，也观察到类似的Hippo信号传导和顶基极化异常。这些结果表明，RHO-ROCK信号在调节河马信号和细胞极化中起着重要作用，从而使ICM和TE谱系得到适当的规范。

关键词：CDX2；细胞谱系；电池极性；胞内质量；滋养层；是的。

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数字

图1
图1
抑制ROCK活性会干扰胚泡腔的形成。从2-细胞期到囊胚期（E1.5–E4.5），胚胎在没有（对照）或有Y-27632的情况下培养。（A） 发展是通过延时摄影记录下来的。对照组和抑制剂处理的胚胎的快照图像对应于发育阶段（从左到右）8-细胞（未压实和致密）、桑椹胚和早期空化（E3.5），以及晚期囊胚腔扩张（E4.5）。h、 hCG注射后小时。（B） 总细胞数的比较。圆圈表示单个胚胎中DAPI染色细胞核的数量，水平虚线条表示每组的平均值。没有统计学上的显著差异（学生t吨-试验）在对照（n=9）和抑制剂处理（n=16）胚胎之间。（C） 母体mRNA的存在岩石1和岩石2在卵母细胞中，通过RT-PCR测定。通道1和8是DNA大小标记（100bp梯形图）。通道2、3和4是岩石1引物（分别为N、M和C）。通道5、6和7是岩石2引物（分别为N、M和C）。（D） 通过岩石抑制破坏紧密连接。显示了TJP1（绿色）免疫染色的代表性胚胎（E4.5）。在对照胚胎中，TJP1在外细胞之间的细胞-细胞接触部位显示为一条连续线，而在处理胚胎中，T JP1显示为不连续或缺失，有时可以观察到TJP1的厚环（箭头）。图像是通过共聚焦显微镜捕获的光学切片的Z轴投影。蓝色，DAPI。比例尺：（A）50µm，（D）20µm。
图2
图2
抑制ROCK活性可促进ICM并减少TE基因表达。从2-细胞期到囊胚期（E1.5-E4.5），胚胎在没有（对照）或有Y-27632的情况下培养。（A） TE谱系标记CDX2（红色）在代表性对照和处理胚胎中的分布（E4.5）。（B） CDX2阳性细胞数量的比较。抑制剂处理的胚胎（n=16）的CDX2表达细胞明显较少（学生t吨-试验）比对照胚胎（n=9）。圆圈表示单个胚胎中CDX2阳性细胞的数量，水平虚线条表示每组的平均值。（C） 多能性标记NANOG（绿色）在代表性对照和处理胚胎中的分布（E4.5）。（D） NANOG阳性细胞数量的比较。抑制剂处理的胚胎（n=10）具有显著更多的NANOG表达细胞（学生t吨-试验）而不是对照胚胎（n＝7）。圆圈表示单个胚胎中NANOG阳性细胞的数量，水平虚线条表示每组的平均值。图像（A、C）是共焦显微镜捕获的光学截面的Z轴投影。蓝色，DAPI。比例尺：20µm。（E） Y-27632处理胚胎早期囊胚期（hCG后100 h）的定量RT-PCR分析。的相对表达水平Tead4、Cdx2、Gata3、Pou5f1、Nanog、和Sox2系统显示为抑制剂处理胚胎中它们的水平相对于对照胚胎中它们水平的百分比。在每组实验中，每个基因的表达水平均由Actb公司条形图表示平均值±标准偏差。P（P）的值Cdx2、Gata3、Nanog、和Sox2系统基于学生t吨-试验表明，Y-27632处理后这些基因的变化具有统计学意义。
图3
图3
ROCK活性通过LATS1/2对YAP磷酸化的干扰对YAP的核定位至关重要。（A） 胚胎在没有或有Y-27632的情况下培养，从2-细胞期到32细胞期（E1.5-E3.5）。核YAP（绿色）在抑制剂处理胚胎的外细胞中减少。显性负性LATS（LATS2-KD）的过度表达可以挽救治疗胚胎中YAP的核定位，而β-珠蛋白的过度表达则不能。细胞边界由F-actin（红色）染色划定。（B） 未处理（对照）和抑制剂处理胚胎中的总核数和YAP阳性核数。（C） 用LATS2-KD和β-珠蛋白过度表达的抑制处理胚胎中的总核数和YAP阳性核数。（B–C）圆圈对应单个胚胎，图中根据核总数（x轴）和YAP正核数（y轴）显示。（D） 核YAP（绿色）在注射了Egfp公司shRNA质粒或混合物车床1-具体和车床2-特异性shRNA质粒。纬度1/纬度2击倒拯救了YAP的核聚积。（E） YAP阳性核数的比较。注射抑制剂处理的胚胎纬度1/纬度2shRNA质粒（n=13）具有明显更多的YAP阳性细胞核（Studentt吨-试验）比注射抑制剂处理的胚胎Egfp公司shRNA质粒（n=14）。圆圈代表单个胚胎中YAP阳性细胞核的数量，水平虚线代表每组的平均值。（F） 用HA表位（绿色）标记的磷酸化缺陷型YAP（YAP-S112A）在未处理和抑制剂处理的胚胎中的分布。YAP-S112A的核定位发生在处理胚胎和对照胚胎中。（G） 核YAP-S112A的数量比较。没有统计学上的显著差异（学生t吨-试验）在对照组（n=10）和抑制剂处理组（n=10）胚胎之间。圆圈表示单个胚胎中HA阳性细胞核的数量，水平虚线条表示每组的平均值。通过共焦显微镜拍摄图像（A、D、F）。蓝色，DAPI。比例尺：20µm。
图4
图4
ROCK抑制剂处理胚胎中极性蛋白的定位。胚胎在无或有Y-27632的情况下培养，从2-细胞期到32细胞期（E1.5–E3.5）。（A–B）PARD6B（A中绿色）和PRKCZ（B中绿色）的免疫染色显示，对照胚胎的外细胞中有较强的顶端膜富集。在Y-27632处理中，PARD6B和PRKCZ显示膜富集延伸至基底外侧区域。（C–D）SCRIB（C中绿色）和LLGL1（D中绿色）的免疫染色显示，对照胚胎的外细胞中有明显的基底外侧膜富集。在Y-27632处理下，SCRIB和LLGL1显示膜富集延伸至顶端区域。（E–F）肌动蛋白丝（E为绿色）和微管（F为绿色）的染色在对照组和Y-27632处理组之间没有明显差异。（G） CDH1（E-cadherin）免疫染色在大多数对照胚胎中显示出明显的基底外侧膜定位。Y-27632处理后，CDH1顶端染色的胚胎数量显著增加。图像是共焦显微镜捕获的光学切片。蓝色，DAPI。缩写：A（顶端），B（基底）。比例尺（A–G）：20µm。
图5
图5
ROCK抑制不会干扰8细胞期胚胎压实时的所有细胞极化事件。胚胎在没有或有Y-27632的情况下培养，从2-细胞（压实）阶段（E1.5–E2.5）。（A–B）p-ERM（A中为绿色）和酪氨酸化微管蛋白（B中为红色）的免疫染色显示，抑制处理的胚胎与对照胚胎相似，在顶端区域保留了强烈的定位。（C） PCM1（绿色）的免疫染色显示，在对照胚胎中，点状物（箭头）聚集在顶端结构域和细胞核之间。随着ROCK抑制，顶点聚集消失。通过F-actin染色（红色）划分细胞边界。图像（A–C）是共焦显微镜捕获的光学切片。（D） PCM1免疫染色胚胎Z轴的光学切片投影（绿色）。蓝色，DAPI。比例尺：10µm。
图6
图6
RHO抑制现象复制了Y-27632诱导的胚胎细胞极性破坏和Hippo信号激活。胚胎在不存在或存在RHO抑制剂I的情况下培养8至32个细胞阶段（E2.5–E3.5）。（A） 核总数的比较。没有统计学上的显著差异（学生t吨-试验）在对照（n=16）和抑制剂处理（n=35）胚胎之间。圆圈表示单个胚胎中DAPI染色细胞核的数量，水平虚线条表示每组的平均值。（B） 代表性胚胎中TE谱系标记CDX2（红色）的免疫染色。在抑制剂处理的胚胎中CDX2减少。图像是光学部分的Z轴投影。（C-D）代表性胚胎顶基极性蛋白的免疫染色。在对照胚胎中，PARD6B（C中为绿色）在顶端区域强烈富集，在外细胞的基底外侧区域弱富集。通过抑制剂治疗，PARD6B在基底外侧区的定位变得更加明显。另一方面，SCRIB（D中绿色）富集于对照胚胎外细胞的基底外侧区，但也局限于处理胚胎的顶端区。图像是光学部分。缩写：A（顶端），B（基底）。（E） 在抑制剂处理的胚胎中，核YAP（绿色）减少。显性阴性LATS（LATS2-KD）的过度表达挽救了YAP在抑制剂处理的胚胎中的核定位。图像是光学部分的Z轴投影。（F） YAP阳性核数的比较。与未经处理的对照胚胎相比，经RHO抑制剂处理的胚胎（n=18）中YAP的核定位显著降低（n=11；学生t吨-测试）。在LATS-KD过度表达的抑制处理胚胎中恢复了YAP的核定位（n=12；学生t吨-测试）。圆圈表示单个胚胎中YAP阳性细胞核的数量，水平虚线条表示每组的平均值。蓝色，DAPI。比例尺：20µm。
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参考文献

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