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.2014年7月22日;111(29):10580-5.
doi:10.1073/pnas.1401591111。 Epub 2014年6月16日。

F1FO ATP合成酶c亚基环内的解偶联通道是线粒体通透性转换孔

附属公司

F1FO ATP合成酶c亚基环内的解偶联通道是线粒体通透性转换孔

Kambiz N Alavian公司等。 美国国家科学院程序. .

摘要

线粒体对内线粒体膜(IMM)的通透性保持严格的调节,以维持ATP的生成。应激事件导致细胞钙(Ca(2+))失调,随后IMM电位迅速丧失,即通透性转换(PT),从而产生渗透移位、代谢功能障碍和细胞死亡。线粒体PT孔(mPTP)的分子特性以前未知。我们发现,F1FO ATP合成酶FO的纯化重组c-亚单位环形成一个电压敏感通道,其持续开放导致细胞内IMM快速且不受控制的去极化。延长高基质Ca(2+)使c亚单位环增大,并将其从ATP合成酶F1中的亲环素D/环孢霉素A结合位点中分离出来,为mPTP开放提供了机制。相反,将重组F1β亚基外源性地应用于纯化的c亚基上可提高孔隙闭合的概率。c-亚单位的耗竭减弱了Ca(2+)诱导的IMM去极化,并抑制Ca(2+)和活性氧物种诱导的细胞死亡,而增加c-亚基的表达或单通道电导对死亡敏感。我们得出结论,高度调节的c亚单位泄漏通道是mPTP的候选。除了细胞死亡之外,这些发现还意味着增加健康细胞中c亚单位通道关闭的概率将增强IMM耦合并提高细胞代谢效率。

关键词:细胞凋亡;兴奋毒性;离子通道;代谢;坏死。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
ATP合成酶c亚基环形成一个大电导离子通道。(A类,上部)切除的蛋白质脂质体斑贴灯记录纯化的c亚单位蛋白。(左侧)振幅直方图显示的电导率为~227 pS、1450 pS和1680 pS;C、 封闭;O1–O3,打开。(赖特)贴片去极化后六次随机记录的振幅直方图。来自左侧以红色表示。C为闭合状态;O1–O3标记在~100–300 pS、~1500 pS和~1800–2000 pS的电导率下的开路水平。也可以看到~500–750 pS的电导率水平,但图中未指定(B类)在1 mM ATP前后从−100 mV到+100 mV的连续斜坡电压钳期间,代表性(~600 pS)切除的蛋白脂质体斑贴灯记录纯化的c亚单位蛋白。(C类)暴露于抗pan-ATP5G1/2/3(c-Sub抗体)、对照抗体(IgG)或2µM CsA前后纯化的c亚单位蛋白的典型斑贴记录。(D类)抗ATP5G1/2/3暴露前后电导峰值的量化(n个= 10, **P(P)=0.0022),对照IgG(n个=3),100µM Ca2+(n个=3),或2µM CsA(n个= 4). (E类)在添加(按顺序)重组CypD蛋白(最终5µg/mL)、100µM CaCl之前和之后,将纯化的ATP合成酶重组成脂质体的代表性斑贴记录2和5µM CsA。(F类)中表示的录制的组数据E类(n个= 12; *P(P)= 0.0228, **P(P)= 0.00391). 红色虚线表示通道活动的关闭状态。
图2。
图2。
线粒体中存在c亚单位大电导离子通道(A类)代表性(~1900 pS,上部; ∼1000 pS,下部)接触100µM Ca前后的SMV贴片灯记录2+其次是抗ATP5G1/2/3(C-sub抗体)或对照抗体(IgG)。条形图显示了峰值电导的量化(上部,N个= 8, *P(P)= 0.0194, **P(P)= 0.0033;下部,N个= 5, **P(P)= 0.0256). (B类)线粒体、SMVs和尿素处理的SMVs的SDS免疫印迹。C-sub ab连接至ATP5G1。(C类)钙治疗前后全生命线粒体、SMV和尿素暴露SMV的典型斑贴灯记录2+然后是环孢素A和ATP(底部跟踪)。(D类)峰值电导对钙的响应2+、CsA和ATP(n个=4个Mito,5个SMV,10个经尿素处理的SMV,5个ATP*P(P)= 0.0045, **P(P)< 0.0001). 闭合(0 pA),用红色虚线表示。
图3。
图3。
c亚基环调节钙2+-诱导IMM解耦。(A类)打开和关闭位置的两个相邻c-亚单位单体的半胱氨酸对标记示意图。当半胱氨酸对一起移动时,FlAsh和随后的荧光发生结合。(B类)HEK 293T细胞中具有代表性的TMRE、FlAsh荧光和合并图像。(C类)转染后72 h HEK 293T细胞中FlAsh荧光强度的时间进程(CC-CC表示两个半胱氨酸对,CC表示一个半胱胱氨酸对)。细胞用载体或2µM CsA预处理1 h,并暴露于2µM离子霉素(离子,箭头所示)。(D类)FlAsh荧光强度的分组数据(n个=12个数据点,每个条件下≥3个独立实验*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)<0.0001,N.S.,不显著)。(E类)将1µM(用于CsA实验)或4µM离子霉素添加到用5µM CsA处理的HEK 293T细胞或用指示的shRNA构建物转染的细胞(Scr,加扰)之前和之后钙黄绿素荧光强度的时间进程。(F类)用于实验的组数据E类添加离子霉素后20分钟(n个=3个细胞、16个细胞、13个细胞、18个细胞用于CsA(1个培养基)、打乱、ATP5G3和ATP5G1 shRNA(三个独立培养基)(***P(P)< 0.0001). (比例尺:10μm)
图4。
图4。
改变c-亚单位表达或包装可调节IMM的电导和对兴奋毒性和ROS介导的细胞死亡的敏感性。(A类)使用所示抗体进行免疫印迹。(B类C类)100µM谷氨酸或20µM h暴露30 min后24 h培养海马神经元碘化丙啶(PI)染色的图像和组数据2O(运行)2含或不含0.5µM CsA(n个≥3种独立培养物,每种条件下56-65张显微照片;G1、ATP5G1;G3、ATP5G3)。(D类)WT和M4 c-亚基环示意图。M4突变体的通道电导增加表明,由于Gly-Val突变,堆积减少,中心孔变大。(E类)用膜片钳记录用WT或M4c亚单位重建的脂质体的代表性。(F类)用指示蛋白质(WT,n个= 38; M1、,n个= 7; 平方米,n个=17;立方米,n个=7 M4,n个=22***P(P)<0.0001(WT vs.M1–M4)。(G公司)归一化NPO(运行)在向含有指示蛋白质(WT,n个= 21; M1、,n个= 3; 平方米,n个= 6; 立方米,n个= 5; M4、,n个= 8; ***P(P)=0.0009比较WT和M4 ATP响应,NPO(运行),通道数乘以每个通道打开的概率)。(H(H))使用所示抗体进行免疫印迹。用抗c-亚单位抗体标记的最上面的条带代表myc/FLAG标记的过表达蛋白。较低的条带丢失了一个标记(blot代表>5个blot)。(J)比重核百分比()和细胞存活(MTT分析)(J),在表达指示结构的HEK 293T细胞中测量(n个=使用三个盖玻片进行两次实验,每个条件下每个盖玻片有两个字段(**P(P)< 0.01, ***P(P)< 0.0001). 在切换到含半乳糖、无葡萄糖培养基24小时后进行测量。(K(K)L(左))暴露于100µM谷氨酸或20µM h谷氨酸30分钟后18小时海马神经元PI染色的图像和组数据2O(运行)2车辆或0.5µM CsA(n个=3个独立培养物,每种条件的38-53张显微照片。(比例尺:B类,C类,K(K),以及L(左),20微米)*P(P)< 0.05, **P(P)< 0.01, ***P(P)< 0.001, ****P(P)< 0.0001.
图5。
图5。
ATP合酶的结构重排揭开了c亚单位孔的面纱。(A类)使用针对哺乳动物myc/FLAG标记的人类ATP合成酶亚基蛋白的抗体进行免疫印迹(代表3个印迹的印迹)。(B类C类)纯化c亚单位的代表性蛋白脂质体膜片钳记录。添加纯化的γ、δ、ε或β亚单位(50 ng/µL记录溶液)(箭头)。(C类,下部)斜坡电压记录。(D类)NP公司O(运行)添加指示的ATP合酶亚基后/前的比率(n个= 5, **P(P)= 0.0036). (E类F类)钙2+-在200nM CsA或0.5mM ADP中诱导的WT心脏或CypD KO线粒体的IMM溶胀测定。绘制的是Ca前后540 nm处的吸光度比(A)2+(n个≥3个)。(G公司)来自WT和CypD KO线粒体裂解物的ATP合成酶IP后上清液和洗脱液的免疫印迹(ATP5G-com或ATP5G1),如E类F类(代表≥4个斑点)。(H(H))凝胶中15-kDa带和120+250kDa低聚物带密度的量化G公司(n个所有波段≥3*P(P)=与对照组相比,120+250 kDa时为0.0331,15 kDa为0.0417)。()ATP合酶F对PT(c-亚单位)孔的调节示意图1. (左侧)CypD和Ca2+扩张c-亚单位环,通过释放F打开毛孔1. (赖特)CsA、Bcl-xL(左)ADP/ATP通过将β-亚基定位在其口腔上方来封闭c亚基孔。

中的注释

  • 确定难以捉摸的线粒体通透性转换孔的成分。
    Karch J、Molkentin JD。 Karch J等人。 美国国家科学院院刊2014年7月22日;111(29):10396-7. doi:10.1073/pnas.1410104111。Epub 2014年7月7日。 美国国家科学院院刊2014。 PMID:25002521 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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