The Phragmoplast-Orienting Kinesin-12 Class Proteins Translate the Positional Information of the Preprophase Band to Establish the Cortical Division Zone in Arabidopsis thaliana

doi:10.1105/tpc.114.124933

.2014年6月；26(6):2617-2632.

doi:10.1105/tpc.114.124933。 Epub 2014年6月27日。

芦苇质体定向激动素-12类蛋白质翻译前置酶带的位置信息建立拟南芥皮层分区

伊丽莎白·利普卡¹, 阿斯特里德·加德琳², 多萝西·斯特克尔¹, 斯特菲·齐默尔曼¹, Geert De Jaeger先生², 大卫·W·埃尔哈特^三, 维克托·基里克⁴, 丹尼尔·范·达姆², 萨宾·米勒⁵

附属公司

¹德国图宾根大学发育遗传学ZMBP植物分子生物学中心，邮编：72076。
²比利时根特大学植物生物技术和生物信息学系，比利时根特VIB，B-9052 Gent。
^三加利福尼亚州斯坦福市卡内基科学研究所植物生物学系，邮编94305。
⁴伊利诺伊州立大学生物科学学院，伊利诺伊州师范，61790。
⁵德国图宾根大学发育遗传学ZMBP植物分子生物学中心，邮编：72076sabine.mueller@zmbp.uni-tuebingen.de。

PMID： 24972597
预防性维修识别码：项目经理4114955
内政部： 10.1105/tpc.114.124933

膜原体定向运动蛋白-12类蛋白质翻译前蛋白酶带的位置信息以建立拟南芥的皮层分裂区

伊丽莎白·利普卡等。植物细胞. 2014年6月.

.2014年6月；26(6):2617-2632.

doi:10.1105/tpc.114.124933。 Epub 2014年6月27日。

作者

附属公司

¹德国图宾根大学发育遗传学ZMBP植物分子生物学中心，邮编：72076。
²比利时根特大学植物生物技术和生物信息学系，比利时根特VIB，B-9052 Gent。
^三加利福尼亚州斯坦福市卡内基科学研究所植物生物学系，邮编94305。
⁴伊利诺伊州立大学生物科学学院，伊利诺伊州师范，61790。
⁵德国图宾根大学发育遗传学ZMBP植物分子生物学中心，邮编：72076sabine.mueller@zmbp.uni-tuebingen.de。

PMID： 24972597
预防性维修识别码：项目经理4114955
内政部： 10.1105/tpc.114.124933

摘要

前相带（PPB）是体细胞分裂中分裂平面的可靠但短暂的预测因子。在整个有丝分裂过程中，PPB的位置信息被持续标记细胞皮层（皮层分裂区）分裂平面的因子通过其独特的时空定位模式保存下来。然而，PPB分解后在质膜上维持这些同一性因子的机制仍然不清楚。驱动蛋白-12类蛋白PHRAGMOPLAST ORIENTING KINESIN1（POK1）和POK2是分裂平面维持的关键参与者。这里，我们显示POK1持续存在于细胞皮层，为PPB以前占据的位置提供了空间参考。光漂白分析结合微管失稳后的荧光恢复显示，在前期，POK1依赖于微管向PPB的动态补充，而POK1在没有皮质微管的情况下在皮质分裂区的保留呈静态。尽管POK1和TAN向PPB的募集在前期独立发生，但在PPB拆卸后，POK函数被严格要求保持分裂平面同一因子TANGLED（TAN）。总之，我们的数据表明，POK代表皮层分裂区的基本早期锚定成分，通过维持下游身份标记翻译和保存PPB的位置信息。

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数字

**图1。**
突变等位基因和突变表型。**（A）**的示意图*POK1*和*POK2系列*基因结构和突变位置。等位基因中的SALK-T-DNA插入*pok1-1*（外显子15），*按钮1-*2（外显子7），*pok2-1*（外显子28），以及*pok2-2*（外显子23）用三角形表示。甲基磺酸乙酯诱导的等位基因无义突变*pok2-3*是一种C到T替换（第16外显子，位于3845 bp位置），导致氨基酸733提前终止（Gln到*）。横线表示外显子。**（B）**（从右到左）的幼苗表型*pok1-1*单个突变体，*pok1-1 pok2-1*双突变体，以及*pok1-1 pok2-3*双突变体。**（C）**发芽10天后平均初生根长度的比较（dag）。灰色条表示野生型（3.4 cm±0.8），虚线条表示*pok1-1*（3.4厘米±0.8），黑条表示*pok1-1 pok2-1*（0.6 cm±0.2），灰色条表示*pok1-1 pok2-3*（0.25厘米±0.09）。的平均根长*pok1-1 pok2-1*和*pok1-1 pok2-3*显著（***P<<0.005，学生t吨test）短于野生型*pok1-1*.显示样品数量。误差条指示±标准偏差.（D）3周龄婴儿玫瑰花结的比较*pok1-1*单个突变体，*pok1-1 pok2-3*双突变体，以及*pok1-1 pok2-1*双突变体植物。**（E）**根分生组织，用碘化丙啶染色以显示细胞壁。鉴于*pok1-1型*单个突变体（左）显示了根细胞文件的常规细胞模式*pok1-1 pok2-3*双突变体（右）细胞模式完全紊乱。棒材=0.5厘米英寸**（B）**和20μm英寸**（E）**。[有关此图的彩色版本，请参阅在线文章。]

**图2。**
细胞分裂持续时间和膈肌扩张方向。主轴（箭头）和语法体（箭头）的方向。**（A）**具有特征性背斜方向的野生型纺锤体和膜质体，膜质体向细胞侧壁扩张，垂直于光学平面。**（B）**A类*按钮1*-*1个pok2*-三中期突变细胞（纺锤体）和胞质分裂期相同细胞（胞浆体）。主轴略微倾斜。膜质以斜向或斜周方向膨胀，从而呈现环面。**（C）**成膜细胞扩张的持续时间在*pok1-1 pok2-3*突变体（58分钟±24分钟，*P>0.01，n个=17）与野生型（37 min±11 min，n个=24）。**（D）**野生型(n个=49），97.96%的观察到的胞膜呈背斜方向，只有2.04%的胞膜环平行于光学平面。相反，在*pok1-1 pok2-3*突变体(n个=43），表达环面（环状视图）的胞浆体比例上升至23.26%。**（E）**野生型（45分钟，19个图像堆栈）和*pok1-1 pok2-3*突变体（60分钟，25张图片）。在有丝分裂的整个过程中，每隔2.5分钟从有丝分裂细胞中以1μm z间隔采集图像堆栈。为所描绘的图像投影每个时间点的最大z投影。白色虚线表示选择进行波形图分析。**（F）**图中描述的各个语法体的时空图（波形图）**（E）**。x坐标表示以微米为单位的距离。y坐标表示时间t。ImageJ中的kymograph插件用于创建kymogram并计算语法体膨胀的速度。曲线仪的斜率（对比边缘，选择用白色虚线表示）与速度成正比。在这些例子中，胞浆的两半以不同的速度膨胀。此外，斜率变化（两相膨胀）表明，速度下降了一半。**（G）**成膜细胞的平均扩张速度在*pok1-1 pok2-3*突变体（0.18±0.09μm/min；P<0.02，n个=22，学生t吨试验），与野生型膨胀率（0.21±0.09μm/min；n个= 43). 误差条指示±标准偏差细胞壁被碘化丙啶染色。微管通过GFP-MBD显示。

**图3。**
皮质分裂区POK依赖性TAN定位丢失与PPB解体相关。**（A）**到**（D）**TAN-YFP被招募到野生型的前期带**（A）**和*pok1-1 pok2-3*双突变体**（E）**在野生型中，TAN-YFP环与前阶段带共存(**[答]**和**【B】**)，主轴前**（B）**，主轴**（B）**和早期晚期的造词法(**[中]**和**【D】**).（E）带有前主轴的单元显示TAN-YFP环。**（F）**中期细胞中的纺锤体与皮质TAN-YFP无关，在胞质分裂过程中信号也不会重新出现(**[女]**到**【H】**表示时间序列）。图像是以1微米的间隔拍摄的不同数量图像的z投影。TAN-YFP环用箭头表示。YFP-TAN的核定位用星号表示。棒材=10μm。**（一）**野生型和非野生型细胞周期中TAN-YFP环的存在*pok1-1 pok2-3*突变体。**（J）**到**（K）**由BiFC测定的TAN和POK1 C末端的相互作用。**（J）**共焦图像*拟南芥*原生质体共存nYFP-POK1_1683-2066以及cYFP-TAN或nYFP-ROP2和cYFP-TAN作为阴性对照。YFP荧光是在TAN和POK1导致荧光团互补时特异性检测到的_1683-2066交互作用与对照实验对比。RFP由同一质粒表达，用作内部对照。**（K）**以平均RFP荧光的比率表示的平均YFP荧光的定量。数据为平均值±标准偏差每个结构体中有26个原生质体，每个原生质体表示独立的转化事件。YFP/RFP比率有显著差异（*P<0.001，学生t吨测试）TAN/POK1之间_1683-2066（相互作用）和TAN/ROP2（无相互作用）。**（左）**到**（N）**原生质体中的控制定位如图所示。图像是以1-μm z间隔拍摄的图像堆栈的最大z投影。棒材=20μm。**（左）**表达后的细胞质定位*Pro35S：TAN-YFP*.（百万）的表达式*Pro35S:YFP-POK1系列_1613-2066*导致质膜中出现点状YFP信号，类似于在*拟南芥*根分生组织细胞。**（N）**的表达式*pUB10:m樱桃-ROP2*.（O）原生质体共存nYFP-POK1的例子_{2006年3月16日}和c-YFP-TAN。图像是以1-μm z间隔拍摄的图像堆栈的最大z投影。棒材=20μm。

**图4。**
POK1位于皮层分区/部位。**（A）**表达YFP-POK1的根分生组织的最大z投影。在横截面中，YFP-POK1定位为宽条带或点（箭头）和锐条带（箭头）。偶尔可以看到YFP-POK1环（带虚线轴的箭头）。一些细胞积聚细胞质YFP-POK1（星号）。**（B）**RFP-MBD和YFP-POK1在根不同细胞周期阶段的共表达。YFP-POK1在前期与PPB共定位，并在整个有丝分裂过程中保持在细胞皮层。黄色大箭头表示纵向齿根轴。**（C）**POK1结构域组织如用于定位研究的荧光蛋白融合的图例和概述所示。POK1_1683-2066片段对应于BiFC实验中使用的TAN相互作用片段（图3J和3K）。Bar=20μm英寸**（A）**和10μm英寸**（B）**.

**图5。**
有丝分裂期间的POK1差异动力学。**（A）**和**（B）**YFP-POK1的FRAP分析。有丝分裂细胞在*拟南芥*根分生组织。的横截面**（A）**前期和**（B）**光漂白前后不同时间点记录的中期细胞。漂白区域由第一个漂白后图像中的虚线方框（ROI）表示（t=0 s）。棒材=5μm。**（C）**和**（D）**漂白前和漂白后时间序列的Kymograph对应于虚线选择，如漂白前图像所示**（A）**和**（B）**描述了四幅预漂白图像的预漂白曲线（橙色虚线）和30幅后漂白图像的后漂白曲线（品红色实线）以及相应的剖面图。剖面图分别显示漂白前（橙色虚线）和漂白后（品红色实线）的平均荧光强度。注意前期YFP信号的恢复。**（E）**绘制了独立FRAP实验的平均值，以拟合上升到最大值（y=a*（1-exp（-b*x））的单指数曲线。在前期细胞中(n个=10），YFP-POK1信号在光漂白后恢复到一半时间（t_1/2)154s，而中期细胞几乎没有任何荧光恢复(n个= 6). 误差条指示±标准偏差.（F）到**（一）**皮质分裂区的POK1定位与MT无关*拟南芥*根分生组织前期细胞与MT报告子RFP-MBD共表达**（F）**和YFP-POK1（G）用10μM谷朊处理前后。PPB用星号表示。**（F）**和**（G）**在谷朊菌培养15分钟后记录下下面板，并与上面板中的细胞相对应。由于MT解聚，RFP-MBD报告子定位成为细胞溶质，而YFP-POK1信号仍然存在于CDZ。棒材=10μm。**（H）**和**（一）**矩形选择的荧光强度剖面图**（F）**和**（G）**描述RFP-MBD（H）奥扎林处理前（连续，品红色线）和奥扎林治疗后（虚线，黑线）和YFP-POK1的信号分布**（一）**奥扎林处理前（连续，绿线）和处理后（虚线，黑线）的信号分布。请注意，经过奥扎林处理后，RFP-MBD峰消失，而YFP-POK1峰保持不变。[有关此图的彩色版本，请参阅在线文章。]

**图6。**
有丝分裂过程中POK1动态的变化。**（A）**一种表达烟草BY-2细胞*Pro35S:GFP-POK1_1213-2066*和*Pro35S:POK1_1213-2066*-GFP和相应的亮场图像。棒材=10μm。**（B）**到**（D）**GFP-POK1C的FRAP分析。**（B）**PPB处GFP-POK1C光漂白后前期BY-2细胞的代表性时间延迟（白色方框表示漂白区域）。**（C）**CDZ处GFP-POK1 C末端光漂白后中期BY-2细胞的代表性时间延迟（用白色方框表示）。**（D）**过度表达GFP-POK1的前期和中期BY-2细胞的FRAP数据图_1213-2066在前期细胞中，GFP-POK1信号在光漂白后缓慢恢复，有一个半衰期（t_1/2)362s，而中期细胞几乎没有荧光恢复。绘制独立FRAP实验的平均值，以拟合上升到最大值（y=a*（1-exp（-b*x））的单指数曲线（前期细胞：n个= 4; 中期细胞：n个=7）。误差条指示±标准偏差.（E）到**（左）**POK1C-GFP的招募需要MT，而PPB-定位的POK1C-GFP与CDZ的静态关联独立于BY-2细胞中的MT。**（E）**到**（J）**代表性分裂BY-2细胞共存*项目35S：RFP-MBD*MT标记和*Pro35S:POK1_1213-2066-GFP。* **（E）**到**（G）**POK1C-GFP与预期带共定位(**[英]**，POK1C-GFP；**[女]**RFP-MBD；**【G】**，合并图像）。**（H）**到**（J）**奥扎林处理后，MT解聚，而POK1C-GFP仍与CDZ相关(**【H】**，POK1C-GFP；**[我]**RFP-MBD；**[日本]**，合并图像）。**（K）**POK1C-GFP FRAP在奥扎林处理的BY-2细胞上的代表性时间延迟**（E）**在没有MT的情况下，POK1C-GFP荧光在漂白的CDZ区域没有恢复。漂白区用白色方框表示。**（左）**图中所示的FRAP实验是在用谷朊菌素处理的前期BY-2细胞上同时进行*项目35S：RFP-MBD*微管标记和*Pro35S:POK1_1213-2066-GFP公司*(n个= 6). MT解聚后，CDZ处的GFP荧光没有恢复。Bar=10μm；误差条指示±标准偏差。[有关此图的彩色版本，请参阅在线文章。]

**图7。**
细胞周期示意图——POK1的依赖性定位和功能。在前期细胞中，POK1和TAN被独立招募到TONNEAU2-依赖性PPB。中期时，POK1在CDZ处固定，同时，TAN以POK1/POK2依赖的方式与CDZ相连，可能通过直接结合POK1的C末端。在胞质分裂末期，POK1和TAN定位通过一种尚不清楚的机制缩小到锚定在亲本壁CDS上的细胞板的确切位置。虚线表示在胞质分裂后期可能存在连接胞浆体和CDS的短暂微管(补充图6). [有关此图的彩色版本，请参阅在线文章。]

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