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.2014年6月27日；9（6）：e100692。
doi:10.1371/journal.pone.0100692。 2014年电子收集。

SUMO2/3靶点的综合鉴定及其在有丝分裂过程中的动力学

朱莉·斯科 1, 克里斯蒂安·德·凯尔斯特拉普 1, 丹尼尔·海沃德 1, 杰斯珀·V·奥尔森 1, 雅各布·尼尔森 1
附属公司

SUMO2/3靶点的综合鉴定及其在有丝分裂过程中的动力学

朱莉·斯科等人。 公共科学图书馆一号. .

摘要

在有丝分裂期间，细胞结构迅速发生大的改变，这在很大程度上受蛋白质翻译后修饰的调节。用泛素相关的小蛋白SUMO2/3修饰蛋白质可以调节有丝分裂的进程，但迄今为止还没有发现有丝分裂靶点。为了加深我们在细胞周期窗口期对SUMO2/3的理解，我们对有丝分裂和有丝分裂退出时SUMO2/3修饰蛋白进行了全面的蛋白质组学表征。我们开发了一种从有丝分裂细胞中高效串联亲和纯化SUMO2/3修饰蛋白的策略。将这种纯化策略与细胞同步程序和定量质谱相结合，可以绘制许多新的靶点及其在细胞有丝分裂结束时的动力学。这表明RhoGDIα是一种主要的SUMO2/3修饰蛋白，特别是在有丝分裂期间，由SUMO连接酶PIAS2和PIAS3介导。我们的数据为进一步探索SUMO2/3修饰在有丝分裂和细胞周期调控中的作用提供了丰富的资源。

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数字

图1
图1。通过串联亲和纯化富集SUMO2/3共轭物。
A） 成熟SUMO2和两个突变体SUMO2 Q87R和SUMO2ΔGG Q87R的C末端序列。Q-R突变以红色突出显示，双甘氨酸结合基序以蓝色突出显示。B） 生成的SUMO2 Q87R和SUMO2ΔGG Q87R融合结构与N末端3*FLAG-His双亲和标记的示意图。C） 随着强力霉素浓度（ng/ml）的增加，连续24小时逐渐诱导SUMO2融合蛋白的表达。SUMO2融合蛋白与靶蛋白结合，而SUMO2ΔGG没有结合。（*）表示未结合的SUMO2融合蛋白。D） 双亲和纯化程序示意图。Ni-NTA纯化、缓冲区变换和抗FLAG亲和纯化的步骤示例也显示在带有检测SUMO2融合蛋白的抗FLAG一级抗体的蛋白质印迹上。第1页 = 损耗1。（*）表示游离3*FLAG-His-SUMO2融合蛋白。
图2
图2。使用定量蛋白质组学鉴定有丝分裂SUMO化靶点。
A） 滚筒瓶中细胞生长和同步协议的示意图。B） 胸腺嘧啶核苷将HeLa FRT TRex SUMO2和HeLa FR T TRex SUMO2ΔGG细胞阻滞在S期，或与胸腺嘧啶核苷类和紫杉醇同步进行有丝分裂，然后在指定时间内加入ZM447439刺激有丝分裂退出。使用抗SUMO2/3、细胞周期蛋白B1和Aurora A抗体作为有丝分裂进展和Vinculin的标记物，通过western blotting分析细胞裂解物。(★)表示未结合的SUMO2融合蛋白(⧫)表示内源性SUMO2/3。C） 定量蛋白质组学策略的示意图。细胞大规模生长，并在滚筒瓶中同步，如A所示。SUMO2ΔGG细胞用轻“L”/R0K0氨基酸同位素标记，并在前中期停滞（灰色），表达SUMO2的细胞用培养基“M”/R6K4氨基酸标记，并表示添加ZM4447439后一小时的有丝分裂退出阶段（绿色），表达SUMO2的细胞用重“H”/R10K8氨基酸标记，并在前中期（红色）停滞。混合来自标记群体的等量细胞裂解液，并纯化SUMO2结合蛋白，如图1所示。SUMO2结合物富集样品用SDS-PAGE分离，用胰蛋白酶消化，用质谱（MS）分析。用针对FLAG、Cyclin B1、Aurora A和Vinculin的免疫印迹抗体分析不同实验条件下的裂解产物，以确定接合状态和有丝分裂期。(★)表示未结合的SUMO2融合蛋白。D） 屏幕I和屏幕II的整个数据集的散点图。该图显示了对数的值2（M/L）和日志2（H/L）SILAC比率，用于识别氨酰化目标。日志处的红色虚线2（M/L） = 1和日志2（小时/升） = 1表示各SILAC对的截止比≥2。每个点代表一个单独的识别蛋白质，屏幕I中识别的蛋白质用蓝色表示，屏幕II中识别的蛋白用紫色表示。分类为SUMO化点击的已识别蛋白质位于虚线截止线上方，颜色较深，而分类为背景的已识别蛋白位于截止线下方，颜色较浅。E） 图中显示了屏幕I（蓝色）、屏幕II（紫色）中SUMO2/3修改的已识别目标（点击）数以及两个屏幕中已识别点击的重叠（深蓝色）数。F） 具有屏幕I和屏幕II日志之间相关性的散点图2确定的SUMO2/3靶蛋白的（H/M）比率。每个点代表一个SUMO2/3目标。显示了皮尔逊相关性R。
图3
图3。有丝分裂中SUMO2/3修饰的动力学。
显示单个修改动态日志的图形2（H/M），屏幕II（紫色）中确定的445个SUMO2/3目标。虚线代表|日志2（H/M）|≥1修正动力学截止值。日志绿线以下2（H/M） = −1，靶细胞在有丝分裂出口处SUMO化程度更高，在log处高于红线2（H/M） = 1，靶点在前中期停搏时被磺胺化，在有丝分裂退出时被去磺胺化。两条线之间的靶点通过有丝分裂在恒定水平上被SUMO修饰，或者在较小程度上表现出动态。在有丝分裂退出时修饰的10个最具活力的靶点和5个最好在前中期进行SUMO化的已识别靶点在图下方用各自的基因名称突出显示。显示了已识别的SUMO通路成分的名称（粗体）和有丝分裂中SUMO化的已知靶点，箭头指示它们各自的比例。
图4
图4。RhoGDIα在前中期被SUMO特异性修饰。
A） RhoGDIα作为SUMO2/3靶点的鉴定。来自屏幕I和屏幕II的SILAC比率和MS数据。B） RhoGDIα的示意图，其氨基酸序列围绕赖氨酸残基K138和K141。一致修饰基序显示，赖氨酸以红色突出显示。C）使用GFP-trap珠从紫杉醇滞留细胞中纯化Venus-RhoGDIα或Venus-RHODIαK138R/K141R。RNAi耗尽SUMO结合途径成分Ubc9和PIAS1-4，用多西环素诱导生成的稳定HeLa FRT Trex细胞系中的Venus-RhoGDIα融合蛋白表达，并添加ZM447439一小时，如图所示。用SUMO2/3和RhoGDIα特异性抗体进行western blotting，分析不同实验条件下纯化的RhoGDI-α和RhoGDI-αK138R/K141R的SUMO化状态。D） 亲代HeLa FRT和HeLa FR T TRex SUMO2细胞被胸腺嘧啶核苷阻滞在S期，或在有丝分裂中与胸腺嘧啶核苷类和紫杉醇同步，随后通过添加ZM447439进行有丝分裂检查点覆盖和进程。用抗细胞周期蛋白B1、RhoGDIα、RhoA和α-微管蛋白抗体对细胞裂解产物进行western blotting分析，结果表明RhoGDI-α本身在有丝分裂中是稳定的。E） 对每个靶点使用3种不同的siRNA寡核苷酸，使用RNAi去除正常HeLa细胞中的RhoGDIα或RhoGDI-β。用RhoGDIα和RhoA特异性抗体进行western blot分析裂解产物的耗尽效率和Rho A稳定性。F） 稳定的HeLa FRT TRex FLAG-RhoGDIα或FLAG-RhosGDIαK138R/K141R细胞被内源性RhoGDI-α耗尽，并被紫杉醇阻止有丝分裂。如图所示，使用外源性RhoGDIα融合蛋白进行救援时，多西环素的浓度增加（ng/ml）。用RhoGDIα和RhoA特异性抗体进行western blot，分析裂解液的消耗效率、外源性RhoGDI-α的表达水平和RhoA-稳定性。G） 稳定HeLa细胞系在有丝分裂过程中表达Venus-RhoGDIα和Venus-RhoGDIαK138R/K141R的延时电影中的代表性静止图像。显示DIC和Venus通道，并指示核膜破裂（NEBD）、中期和后期的时间。H） 作为F），但使用Venus-RhoGDIα。
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