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.2014年6月18日；34(25):8585-93.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2935-13.2014。

Nrf2上调血脑和血脊髓屏障ATP结合盒转运体的表达和活性

王学谦 1, 克里斯托弗·坎波斯 1, 约翰·皮尔特 1, 林赛·K·史密斯 1, 杰西卡·博尼 1, 罗纳德·坎农 1, 大卫·S·米勒 2
附属公司

Nrf2上调血脑和血脊髓屏障ATP结合盒转运体的表达和活性

王学谦等。 神经科学. .

摘要

在脑缺血、创伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血和脊髓损伤的动物模型中，激活氧化应激传感器核因子E2相关因子-2（Nrf2）具有神经保护作用。我们在此表明，体内或体外用萝卜硫烷（SFN）激活Nrf2可增加血脑屏障处三个ATP驱动的药物外排泵的表达和转运活性[P-糖蛋白，ATP结合盒b1（Abcb1）；多药耐药相关蛋白-2（Mrp2），Abcc2；乳腺癌耐药蛋白（Bcrp），Abcg2]。给大鼠注射SFN可增加脑毛细血管中所有三种转运体的蛋白表达，并减少50%的P-糖蛋白底物维拉帕米的脑蓄积。大鼠或小鼠脑毛细血管暴露于SFN后，P-糖蛋白、Bcrp和Mrp2转运活性和蛋白表达增加；SFN增加小鼠脊髓毛细血管中的P-糖蛋白活性。抑制转录或翻译可消除P-糖蛋白活性的上调。在Nrf2-null小鼠的脑毛细血管中未观察到此类影响，表明Nrf2依赖性。Nrf2间接信号转运体活性/表达增加。p53抑制剂pifithrin可消除SFN诱导的转运体活性/表达增加，p53活化物nutrin-3可增加P-糖蛋白活性。SFN并没有改变p53小鼠脑和脊髓毛细血管中的P-糖蛋白转运活性。p38 MAPK和核因子κB（NF-κB）抑制剂阻断SFN和nutlin-3对P-糖蛋白活性的影响。这些结果表明，Nrf2、p53和NF-κB在血-CNS屏障上上调P-糖蛋白、Bcrp和Mrp2。这意味着氧化应激会选择性地加强屏障（外排转运体上调），增加神经保护，但也会减少许多治疗药物的渗透。

关键词：ABC运输车；核因子-κB；P-糖蛋白；血脑屏障；药物传递；第53页。

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数字

图1。
图1。
SFN剂量（1–10 mg/kg，i.p.，持续2 d）对大鼠血脑屏障ABC转运蛋白表达和功能的影响。A类脑毛细血管膜（来自5只大鼠的混合组织）的蛋白质印迹显示，SFN剂量增加了三种ABC转运蛋白和Nrf2应答基因HO-1的蛋白表达。Pgp，P-糖蛋白。B类，对照组和SFN剂量大鼠脑毛细血管的典型共焦显微照片（比例尺，10μm）。从对照组和SFN剂量的大鼠中分离出毛细血管，并用2μ米NBD-CSA无和有5μ米PSC833（中间；体外分析）。C类，从对照和SFN给药的大鼠中分离的毛细管中特定NBD-CSA管腔荧光的定量(体外分析）。所示为单个制剂中8-12条毛细血管的平均值±SEM（来自5只大鼠的大脑集合）***第页<0.001，显著高于对照组。天，SFN剂量可减少[三H] 维拉帕米（P-糖蛋白底物）的测定方法就地脑灌注。每个点代表单个老鼠的值**第页<0.01，显著高于对照组***第页<0.001，显著高于对照组。E类，SFN剂量不会改变[14C] 蔗糖（紧密连接渗透性标记）。数据来自每组五只大鼠。
图2。
图2。
SFN暴露对离体大鼠脑毛细血管中ABC转运蛋白转运活性的影响（转运蛋白选择性荧光药物的特定管腔积聚；见结果）。A类，SFN诱导P-糖蛋白转运活性增加的时间过程。毛细血管在含有5μ米SFN的显示时间，然后用SFN和2μ米NBD-CSA。B类，P-糖蛋白活性的SFN剂量反应。暴露时间为4小时（SFN为3小时，SFN为1小时，2μ米NBD-CSA）。C类，暴露于t吨必和必拓。天SFN暴露增加脑毛细血管中的Mrp2和Bcrp转运活性。所示为单个制剂中10-15条毛细血管的平均值±SEM（8-10只大鼠的大脑集合）*第页< 0.05, **第页< 0.01,***第页<0.001，显著高于对照组。
图3。
图3。
SFN诱导的P-糖蛋白活性增加需要转录和翻译（大鼠脑毛细血管）。A类，转录抑制[1μ米放线菌素D（ActD）]或翻译[100μg/mL环己酰亚胺（CHX）]消除了因暴露于5μ米SFN公司。所示为单个制剂中8-12条毛细血管的平均值±SEM（10只大鼠的大脑集合）***第页<0.001，显著高于对照组。B类,C类脑毛细血管膜的Western blot显示，毛细血管暴露于SFN 4h后，P-糖蛋白（Pgp）的表达以浓度依赖的方式增加。
图4。
图4。
Nrf2（SFN）和AhR（TCDD）配体和p53激活（nutlin-3）对野生型脑毛细血管中P-糖蛋白转运活性的影响(A类,B类)和Nrf2-null(C类,天)老鼠。所示为单个制剂中8-12条毛细血管的平均值±SEM（10只小鼠的大脑集合）**第页< 0.01, ***第页<0.001，显著高于对照组。
图5。
图5。
p53参与SFN诱导大鼠脑毛细血管ABC转运蛋白表达和活性。A类，Nutlin-3，一种p53激活剂，以浓度依赖的方式增加P-糖蛋白活性。B类，Pifithrin，一种p53抑制剂，阻止SFN诱导的P-糖蛋白活性增加。所示为单个制剂中8-12条毛细血管的平均值±SEM（10只大鼠的大脑集合）**第页< 0.01, ***第页<0.001，显著高于对照组。C类Western blot显示SFN暴露毛细血管膜中P-糖蛋白（Pgp）、Bcrp和Mrp2表达增加。当p53被吡氟菊酯抑制时，转运体表达的增加被消除；收集10只大鼠的毛细血管膜。Con，控制。
图6。
图6。
Nrf2（SFN）、AhR（TCDD）和PXR（PCN）配体对野生型脑毛细血管P-糖蛋白转运活性的影响(A类)和p53-满(B类)老鼠。所示为单个制剂中8-12条毛细血管的平均值±SEM（10只小鼠的大脑集合）***第页<0.001，显著高于对照组。
图7。
图7。
p38 MAPK抑制剂（SB203580）对SFN暴露引起的P-糖蛋白转运活性增加的影响(A类)和nutlin-3(B类). 所示为单个制剂中10-12条毛细血管的平均值±SEM（6只大鼠的大脑集合）***第页<0.001，显著高于对照组。
图8。
图8。
A类NF-κB抑制剂（QNZ）可阻止因接触SFN和nutlin-3而引起的P-糖蛋白转运活性的增加。B类，第二个NF-κB抑制剂（SN50）阻止因接触SFN而引起的P-糖蛋白转运活性的增加。所示为单个制剂中8-12条毛细血管的平均值±SEM（6只大鼠的大脑集合）***第页<0.001，显著高于对照组。
图9。
图9。
A类EMSA显示Nrf2、p53和NF-κB在大鼠脑毛细血管暴露于5μ米4小时SFN控制。B类，p65的免疫染色显示5μ米SFN中。箭头表示为像素强度剖面分析选择的核。C类，对照组和SFN暴露毛细血管中免疫染色（p65）细胞核的像素强度分布。强度轮廓中没有重叠。天，免疫染色（p65）毛细血管中的平均核像素强度。SFN暴露使像素强度增加一倍以上，p53、p38和NF-κB的激活和易位抑制剂基本上阻断了这种增加。所示为两种毛细管制剂中40–60个细胞核（15–25个毛细血管）的平均值±SEM*第页< 0.05, ***第页<0.001，显著高于对照组。E类，Nrf2配体增加P-糖蛋白表达的事件序列。激活剂显示为红色，抑制剂显示为蓝色。
图10。
图10。
Nrf2（SFN）、AhR（TCDD）和PXR（PCN）配体对野生型脊髓毛细血管P-糖蛋白转运活性的影响(A类)和p53-满(B类)老鼠。所示为单个制剂中10-12条毛细血管的平均值±SEM（10只小鼠的大脑集合）*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，显著高于对照组。
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